胚胎植入前遗传学筛查

20年前，我国育龄人群中的不孕不育率仅为3%，处于全世界较低水平。2009中国不孕不育高峰论坛公布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，全国不孕不育患者人数已超过5000万，以25岁至30岁人数最多，呈年轻化趋势。平均每8对育龄夫妇中就有1对面临生育方面的困难，不孕不育率攀升到12.5%~15%，接近发达国家15%~20%的比率。最为严峻的是，这一发生比例还在不断攀升，卫生组织专家预估中国的不孕不育率将会在近几年攀升到20%以上。

卫生组织专家认为，精神和环境的双重压力让付出沉重的“生命代价”不孕不育已成为严重的社会问题。如何有效帮助不孕不育患者解决生育难题，对于社会，医院及大夫都提出了更高的要求。

胚胎异常是体外受精最终失败的主要原因之一。英国研究人员开发出一种可筛查胚胎质量的新技术，有望提高试管婴儿的成功率。

在这种背景下，试管婴儿技术应运而生。试管婴儿技术是将卵子与精子分别取出后，置于试管内使其受精，受精卵发育为胚胎，后移植回母体子宫发育成胎儿的技术。试管婴儿技术作为有效的辅助生殖手段成为大多数不孕不育夫妇的重要选择，目前平均成功率为20-30%。

第一代试管婴儿（in vitro fertilization,IVF体外受精）解决的是因女性因素引致的不孕

第二代试管婴儿（intra cytoplasmic sperm injection,ICSI单精子卵细胞浆内注射）解决因男性因素引致的不育问题

第三代试管婴儿（pre-implantation genetic screening/diagnosis,PGS胚胎植入前筛查）帮助人类选择生育最健康的后代

试管婴儿技术给不孕不育夫妇们带来了希望，越来越多无法自然受孕的夫妇选择试管婴儿，并成功拥有了自己的宝宝。科学研究发现，要想成功妊娠，健康胚胎很关键。而通过试管婴儿方法获得的胚胎有40-60%存在染色体异常，且随着孕妇年龄越大，胚胎染色体异常的风险越高。染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因。因此，健康的胚胎是试管婴儿成功的第一步，所以植入前遗传学筛查（PDS）技术开始越来越受到重视。

图1.生育率和流产率与孕妇年龄的关系*

*数据来源Sheps MC,Menken JA,1971和Fedrick J,Anderson AB，1976

PGS的出现是辅助生殖技术和分子生物学技术飞速发展的结果。应用PGS技术通过挑选正常的胚胎，意义显著。

（一）PGS可选择健康胚胎，提高试管婴儿成功率，降低流产率

与传统依赖显微镜技术，挑选形态学等级高的胚胎进行移植的胚胎形态学相比，PGS可直接对胚胎的遗传物质进行分析，准确判断胚胎是否存在染色体异常，筛选出真正健康的胚胎。

有临床试验数据显示，PGS可将接受辅助生殖治疗的反复流产人群的流产率从33.5%降低至6.9%（Hodes-WertzB，2012），同时将临床妊娠率从依赖形态学的45.8%提高至70.9%（Yang，2012）。MartinD.Keltz等人最新发布的研究结果显示，PGS可以显著改善IVF的各项指标（具体参照表1.形态学与PGS筛选的胚胎移植后多项指标对比）。PGS可以显著改善第一、二代“试管婴儿”的各项指标，可以从根本上提高第一、二代“试管婴儿”的妊娠成功率，降低自然流产率，提高妊娠质量。

（二）避免多胎妊娠，减少实施减胎术

因为试管婴儿平均成功率为20-30%，为提高一次植入成功率，一般会同次植入2-3个胚胎，因此往往会出现一些多胞胎的现象。多胞胎比单胎更具有风险性，这种危险对于妈妈和孩子来说都存在。权威调查发现双胞胎的剖宫产率78.45%，早产占47.07%，合并症和并发症占39.7%。双胞胎以及多胞胎的母亲更容易在怀孕期间发生糖尿病、高血压等妊娠期综合征，而且产后出血的概率也要高，同时也比较容易发生早产。早产的孩子大都会发生先天性肺部疾病，而且这种疾病将是终生的。

因此，为了保护母子的安全，三胞胎以上，原则上需要进行减胎术，减胎手术有10%的机会造成全部胚胎流产。国际著名生殖医学专家库克教授，一直建议如果采用试管婴儿的方式，最好只接受一个受精卵的移植，他不建议试管婴儿生双胞胎，因为这种方法对母子并没有多大好处。虽然美国没有强制规定，但是如果给女性移植胚胎，最后生出双胞胎，那么医生的这次移植通常会被视为不成功的移植。

利用PGS技术选择健康胚胎，提高试管婴儿成功率，可以避免了因盲目地移植了多个胚胎以提高妊娠成功率，导致多胎妊娠而不得不在孕期实施减胎术造成的危害及伦理道德上的冲突。

表1.形态学与PGS筛选的胚胎移植后多项指标对比*

*数据来源BrookeHodes-Wertz,JamieGrifo,etal.(2012).FertilityandSterility,98:675-680.ZhihongYang,JiaenLiu,etal.(2012).MolecularCytogenetics,5:24MartinD.Keltz,MarioVega,etal.(2013).JAssistReprodGenet,30:1333–1339.

1990年，英国Handyside成功地用聚合酶链反应（PCR）技术分析卵裂球对性连锁性疾病携带者进行胚胎性别筛选后的妊娠分娩，完成了世界上第一例PGS，开创了产前筛查的新纪元。进入90年代，植入前筛查技术有了飞速发展。

1994年，Monne用荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization，FISH)技术，在植入前筛查染色体非整倍体及胚胎性别获得成功。此后，多重PCR，荧光PCR，多色FISH等技术陆续发展。

1998年FISH开始应用于染色体平衡易位的PGS。通过选择正常和平衡配子或胚胎，PGS可显著降低染色体易位导致的反复自然流产率。同年，商业化供应的能同时筛查13，18，21，X和Y五条染色体的五色探针也开始用于PGS中进行高龄妇女卵子和胚胎的非整倍体筛选。

1999年以来陆续开展的间期核转换（interphasenuclerconversion)技术，比较基因组杂交(comparativegenomichybridization，CGH)，全基因组扩增（wholegenomeamplification,WGA）技术相继用于PGS，进一步促进了该技术的研究和应用。

2010年以来，高通量测序技术（High-throughputsequencing）开始飞速发展，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，对一个胚胎的基因组进行细致全貌的分析成为可能，将PGS带入全新的领域。

国内外对PGS技术的研究热情一直没有停止过，目前PGS技术层面面临的挑战主要有以下两点：

(一)如何安全有效地获得胚胎的遗传物质以供检测。

PGS可活检的遗传物质有：

(1)配子如精子或卵子；

(2)卵裂期胚胎的卵裂球；

(3)囊胚滋养外胚层细胞。每种遗传物质的活检都有其优缺点。

l配子。受精前取配子进行筛查的用法，目前尚不多。这种方法的问题关键在于如何完成精子或卵子的遗传分析，同时又不影响其受精能力。目前较多用卵子进行PGS，主要是利用第一极体或第二极体的遗传学分析，间接推断卵子正常与否。但是，用极体分析来推断卵子的基因组或其染色体结构和数目，并不能完全反映卵子遗传组成的真实情况。而且极体仅能反映母方的遗传规律，而不能反映来自父方的遗传规律。

l卵裂球。卵裂球活检是现在PGS取材的主要途径。一般选培养到第三天，6～10细胞期的卵裂球，此期的细胞具有全能分化的潜能，取出1～2个细胞，不会影响胚胎的发育。卵裂球带有父母遗传给胚胎的全套基因组，可以进行比较全面的检查。

囊胚细胞。囊胚期活检是PGS筛查的另一途径。这种方法是在体外将受精卵培养到第五天，用显微操作法从囊胚期胚胎滋养外胚层吸取5-10个细胞作遗传学筛查。用囊胚期胚胎细胞的优点是无碎片和降解细胞，而卵裂期胚胎常有碎片和降解细胞。因为不影响内细胞团，故不会累及胚胎发育。但是受培养技术的限制，40%以上胚胎不能在体外很好地发育到囊胚期。因此，无法获取囊胚期细胞进行PGS。虽然取一定数量的囊胚期细胞不会影响胚胎的正常发育，但内细胞团和滋养外胚层细胞的遗传构成并非完全相同，故用滋养外胚层细胞进行PGS有可能造成误诊。筛查时分别用几个细胞分析比用单个细胞筛查的方法更好，可以降低误诊率。

(二)如何克服极低样本量对筛查的准确性以及有效性的影响。

因为只能取到极少量的细胞（最低只有1、2个），取到细胞之后如何在低样本量进行准确检测是急需解决的问题。目前的方法有：

荧光原位杂交FISH技术

染色体分析普遍采用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）。将DNA探针用不同颜色的荧光染料标记，与固定在玻片上的细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光。从而对染色体异常进行筛查。FISH仍是目前筛查染色体病的主要方法。主要用来筛查染色体非整倍体，特别是13、18、21、X和Y染色体的数目异常。

但是FISH技术目前存在的问题，在于无法一次性检测所有染色体，一般每个卵裂球细胞只能标记5条染色体，约需5个多小时。最多只能用三轮FISH检测13条染色体来，而且随着核变性次数的增多，探针的杂交效率也降低。因此，在对胚胎进行非整倍体筛查的PGS中无法同时筛查全套23条染色体，不能做到真正意义的核型分析。有报道应用FISH技术至少有约20%的非整倍体漏诊^[2]。

芯片技术

比较基因组杂交技术(comparativegenomehybridization，CGH)曾经是唯一能在单细胞水平提供整套染色体遗传信息的方法。其原理是将检测DNA和参照DNA用不同荧光色标记，然后逆向竞争杂交，通过双色荧光强度比分析，可检测全基因组DNA的缺失和增加，从而对全套染色体进行遗传学分析。近年来，随着芯片CGH技术的发展，筛查的时间缩短至48h内。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymophisms，SNP)芯片的原理与CGH芯片不同。SNP芯片筛查中通过与父母SNP位点的对比，可以判断胚胎染色体的单倍型，而荧光强度也可用于判断染色体的数目。SNP芯片目前价格昂贵。

全基因组扩增技术

全基因组扩增(wholegenomeamplification，WGA)是最近出现的，一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。

用WGA法能够无选择偏见地扩增整个基因组。从理论上讲，任何基因都能从WGA的产物中检测出来。同时也可将信息保存起来。无论其起始标本量如何，每100μL体系DNA量均为80μg，DNA产物的平均长度为12kb，最长可以达到100kb。通过一些方法分析这些DNA产物，可以得到更多全面的染色体信息。利用高通量测序技术，每张测序芯片可以轻易的同时测定超过15亿条DNA序列，产出300Gb的原始数据，相当于1个人类基因组的100倍，这样一种灵敏度极高的检测技术，有望能够快速、准确检测早期胚胎的染色体数目和结构异常，应该具有广阔的前景。

步骤1：药物刺激卵巢超排卵

女性自然月经周期一次仅排出一个成熟的卵子，受精后只能形成一个胚胎，而移植一个胚胎的妊娠率是很低的。为了获得多个可用于检测和移植的胚胎，需要利用激素类药物刺激卵巢超排卵。

步骤2：采集卵巢中的卵子

超排卵药物使用后，超声和激素水平变化监测卵子的成熟度。当卵子成熟后，采集卵子。同时采集精子。

步骤3：两种方式完成受精

l体外受精（IVF）：将卵子与精子放置在同一个培养皿中，共同培养，使其自然受精。

l卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）：当精子质量差时，无法自然受精，需利用ICSI完成受精。

步骤4：受精卵体外培养

受精完成后，需监测每个受精卵是否受精成功，并将受精后的受精卵体外培养。

步骤5：胚胎活检

从体外培养三天的卵裂球中选取一个卵裂球细胞，或从培养五天的囊胚中选取若干个囊胚滋养层细胞于培养皿中。

步骤6：PGS检测胚胎细胞

对上述选取的胚胎细胞进行PGS检测。

步骤7：胚胎移植

挑选1-2个PGS检测正常的胚胎移植至女方子宫内，冷冻剩余的正常胚胎，若首次胚胎移植失败可用于后续的移植。

步骤8：确认是否怀孕

胚胎移植后两周，通过尿检或验血确认是否怀孕。IVF受孕孕妇的妊娠期监护，与自然受孕的孕妇相同。

高龄孕妇(年龄≥35岁)

反复自然流产史的孕妇（自然流产≥3次）

反复胚胎种植失败的孕妇（失败≥3次）

生育过染色体异常疾病患儿的夫妇

染色体数目及结构异常的夫妇