体积排除色谱

体积排除色谱(size exclusion chromatography，SEC)方法，通常是一种对于分子量大于2000的物质按其分子尺寸大小进行分离的技术。作为液相色谱技术的一个重要分支，SEC方法最广泛的用途是测定合成聚合物的分子量分布；对于某些大分子样品如蛋白质、核酸等，也是一种很有效的分离纯化手段。SEC方法能简便快速地分离那些样品组分中分子量相差较大的简单混合物。它非常适合于未知样品的初步探索分离，无需进行复杂实验就能获得样品组成分布方面较为全面的概况。

SEC方法按其淋洗体系通常分为两大类，即水相SEC(也称凝胶过滤色谱)和有机相SEC(也称凝胶渗透色谱)。两种方法的分离原理虽然是相同的，但柱填料及其分离对象和使用技术完全不同。^[1]

在文献上，体积排除色谱的名称曾很混乱，这是由于其发展历史及所用分离材料的不同等因素所造成的。

1953年，Porath和Flodin首先用交联葡聚糖凝胶在水溶液中分离水溶性高分子。这种交联葡聚糖凝胶的商品名称，即是后来广为人们所知的Sephadex。由于其突出的优点，立即得到了生化界的承认和广泛的应用。这种分离技术被称为凝胶过滤(gel filltration chromatogr.)。

在水溶液体系中的成功，促使人们去研究非水有机溶剂体系中的凝胶色谱。1964年，Moore以苯乙烯一二乙烯苯共聚物为基质的不同孔径的有机高分子凝胶，解决了分子量几千至几百万的合成高分子的体积排除色谱分离问题。在分离高分子分级与分子量测定领域内，被称之为凝胶渗透色谱(gel permeation chromatogr．)。1965年Waters公司的专用凝胶色谱仪问世(GPC 200)。以后的几年中，从理论到仪器乃至应用等各个方面，凝胶色谱得到了快速发展并日臻完善，成为高效液相色谱家族中重要的一员。

关于名称，20世纪70年代时曾统一为凝胶色谱(gel chromatography)。但是，体积排阻色谱这一名称似乎能更确切地反映其分离过程的本质。因此，以称其为体积排阻色谱为宜。不过，SEC主要的应用领域是生化分离和高分子科学，前者仍习惯地将其称之为凝胶过滤色谱，而后者，更习惯地沿用凝胶渗透色谱的名称。^[2]

与其他几种色谱分离模式相比，体积排阻色谱具有几个突出的优点：

(1)出峰迅速，任何组分的保留体积均在K和%之间；

(2)溶质与固定相(填料)和流动相无相互作用，毋需梯度淋洗；

(3)分离时不会滞留杂质或残留物在柱上，故柱寿命长；

(4)对于大分子，可以测定分子量及分子量分布；

(5)对于生物大分子，有很高的活性回收率；

(6)柱负载较大，利于制备分离。^[1]

作为一种分离方法，它也有本身难以克服的缺点。即，与其他色谱模式相比，体积排除色谱的分辨率及峰容量均相对较低。^[1]

体积排除色谱的分离，是在装填有多孔性材料的色谱柱中进行的。多孔材料的孔有大有小。孔径，有其“孔径分布”。当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后，溶质会因浓度差而渗入或扩散进入填料的孔中。也就是说，溶质在两相中的运动的动力是浓度梯度。但是，分子体积的大小，造成了在孔中扩散路径的差异。形象地说，填料颗粒上的孔有大有小，但对于溶剂分子来说，它们是足够大的，可以允许它们自由地扩散、进出。不过，对于体积大的分子来说，它们只能进入尺寸大于该分子的孔，对于比颗粒上的孔还要大的分子，它只能从孔旁流过。换句话说，分子量或分子尺寸较小的溶质，能占有更多的孔体积。这样，分子体积不同的混合物一齐进入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分子先流出柱子，分子量小的(即体积小)分子滞后流出。^[1]

在SEC方法中，柱填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配。欲分离的高分子样品可能是油溶性的，也可能是水溶性的，前者只能在有机相体系中分离，后者只能在水相体系中分离，填料必须能被淋洗剂所浸润。SEC方法要求填料与试样尽可能不发生任何基团之间的相互作用，即在色谱过程中应尽可能避免非空间排除效应(如吸附、离子交换、分配等相互作用)的影响，而是完全按照分子尺寸大小进行分离。填料的多孔结构是SEC方法赖以建立的基础。有关填料的孔结构参数(如孔度、孔径、孔径分布以及孔结构形态等)对于SEC技术来说尤为重要。

一种高效的SEC填料，它的化学结构应当能够很好地适应欲分离对象和淋洗体系，并能有效地避免非空间排除现象的发生；它的物理结构除了具备均匀而合适的颗粒度外，还需要有光洁的表面(包括孔壁表面)、规整而通畅的孔结构形态、较大的孑L度以及适当的孔径大小与分布。

SEC填料的色谱表征，除了前面所述的柱效、选择性、分离度、穿透性等参数以外，还需满足如下三项色谱指标要求。^[3]

表示填料可以用来分离高分子物质的最大限度、超过这个限度溶质就会在填料的粒隙间穿过而没有分离效果。排除极限主要取决于填料最大的有效孔径。^[3]

表示填料可以分离高分子物质的分子量范围。它一般指分离柱的分子量一淋洗体积校正曲线的线性部分。分子量高于和低于这个范围的溶质分别被排除和渗透，均没有分离效果。分离范围主要取决于填料有效孔的分布范围。对于高分子类型SEC填料，分离范围通常以相差2个数量级的分子量为宜。^[3]

指填料的有效孑L内体积与填料的颗料间隙体积之比值。它反映了色谱柱的分离容量，其值越大越好。在紧密填充的条件下，固流相比主要与填料的孔度有关。

以上所述，既是填料在制备过程中的主要研究内容，也是填料在应用过程中的重要参考依据。^[3]