亲和膜色谱

亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的顺序，对生物产品进行分离纯化。

纤维素膜、聚酰胺膜、聚砜膜，聚烯烃膜；

聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、全氟聚合物等；

聚醚脲烷类膜和凝胶-纤维玻璃膜。

亲和膜是亲和色谱及膜分离的结合，亲和膜过程所采用的设备与膜分离所用类似，也是在膜组件如中空纤维组件、平板式组件等中进行，而其操作过程又类似于亲和色谱将样品混合物缓慢地通过膜，使其中与亲和配基有特异性相互作用的分子和配基产生偶合，生成相应的配合物，然后再通过改变条件，如洗脱液组成、pH值、离子强度、温度等，使己和配基产生相互作用的配合物分子解离，将其收集起来，再将膜进行洗涤、再生和平衡，以备下次分离用 ^[1] 。

理想的亲和膜基质具有的特征是高的孔隙率，大的内外表面积，高的化学、生物、机械稳定性，一定的亲水性，低的非特异性吸附，存在可化学反应的基团，高结合容量，耐溶剂冲洗，成本低，重复性好。亲和膜基质材料按来源大致可为天然聚合物和合成聚合物，目前研究较多的是纤维素膜、尼龙膜、聚矾膜，聚乙烯中空膜，另外一些可用做亲和膜基质材料的还原聚羟乙基甲基丙烯酸酯、壳多糖、甘油基甲基丙烯酸酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯醇、聚醚脲烷类聚合物、无机膜如玻璃中空纤维膜等。

基于在微孔滤膜或超滤膜上所具有的某些官能团，通过适当的化学反应途径，将其改性，接上一个间隔臂，一般应是大于3个碳原子的化合物。

配基可以直接固定在基质材料上，但有时候空间效应会影响到配基与生物大分子的作用，这时就要考虑引入间隔臂分子，以提高配基的使用效率。最普遍的方法就是将通式为NH2(CH2)nR的ω-氨烷基化合物与基质偶连，然后在间隔臂上接上配基。一般认为，为了获得最佳偶合作用，配基与膜之间必须插人至少一个亚甲基的桥。但如果生物大分子的表观相对分子质量低或与固定配基的亲和性高，则间隔臂长度不如在大蛋白或低亲和系统中要求严格。最近又有提出采用亲水性更强的间隔臂代替疏水间隔臂，能极大地降低非生物特异性吸附作用。

配基是指底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物或其它任何能特异地和可逆地与欲纯化的蛋白质或大分子物质发生相互作用的分子。亲和膜分离的机制就是利用配基与目标分子的特异性相互作用，因此，如果能找到合适的配基，原则上就能对目标物质进行分离了。配基按其来源可分为两大类天然配基和人工合成的配基，按其特异性又可分为生物特异性配基和基团特异性配基。生物特异性配基是指利用自然界中特异性相互作用生物物质对之一做配基，如酶一底物、酶一抑制剂、激素五补接受体、抗体一抗原等。基团特异性配基是指对具有某一类基团或结构的生物大分子均有特异性作用的配基，如氨基酸、蛋白质A、活性染料、金属鳌合离子等 ^[2] 。

天然配基对于一定的生物分子具有内在的生物特异性吸附作用，而合成的配基则经常是通过变换及优化偶合和洗脱条件来实现其特异性作用。虽然从性能上说，天然配基要优于合成配基，但天然配基的制取和提纯较困难，价格昂贵，而且它们对使用条件的要求也比较苛刻。因而，实际中用得更多的是量大而又相对便宜的配基，如生物活性染料，由于它可与多种脱氢酶、己糖激酶、碱性磷酸酯酶、羧肽酶、白蛋白等结合，成为目前应用最广的配基。近年来，以鳌合金属离子为配基的固载化金属亲和色谱（IMAC）得到发展。IMAC的作用机理是：路易斯酸即鳌合的过渡金属离子如Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)作为电子对供给者能和组氨酸、胱氨酸、色氨酸等电子接受体作用。因此，IMAC多用于从氨基酸混合物中分离出组氨酸以及考察蛋白质中的组氨酸残基。相比其它基团特异性配基，IMAC在配基稳定性、容量、活性蛋白质的回收及成本上都比较优越。

总体来说选用一个适合的亲和配基，在一定条件下让其与间隔臂分子产生共价结合，生成带有亲和配基的膜分离介质。

具体的亲和膜的制备主要分为3步：成膜，功能化，活化，按它们进行的先后顺序不同可分为以下几种途径

（1）膜材料→功能化的膜材料→功能化的膜→活化的膜

（2）膜材料→膜→功能化的膜→活化的膜

（3）膜材料→功能化的膜材料→活化的膜材料→活化的膜

功能化即通过引人适当的基团,使膜材料或膜改性。而活化则是使引人的基团活性增强，能与配基作用。

具体采用哪一种途径更好，因材料而异，一般认为，活化在成膜后进行更好一些。成膜方法和一般的制膜方法一样，主要是采用溶胶一凝胶转化法，也可采用静电纺丝法制得膜。

功能化的方法可以通过一般的化学反应，也可以通过辐射接技引人所需基团，或者在膜表面覆盖一层带基团的涂层。引入的基团（象经基、酞胺基团）多为亲电性的，使膜更易于与配基或间隔臂上的亲和基团反应。

膜的活化是指用一些双官能团试剂与膜作用。常用活化法有溴化氰法、环氧法、羰基二咪法等。活化时应注意，通常活化和配基的偶合同时进行，而配基多为脆弱的生物分子，因此活化时间不能太长；此外配基的泄漏导致产品污染也应予以考虑，尤其是当亲和膜用于分离医药制品时。理想的活化和偶合应该满足：

（1）条件温和，快速、高效并且无副作用地形成稳定的共价键；

（2）偶合完成后剩余的活性基团可用简单的方法封闭；

（3）所用试剂无毒、便宜，易于工业放大使用。

将样品混合物缓慢地通过膜，使样品中欲分离的物质与亲和配基产生特异性相互作用，生成配基和配位物为一体的复合物，其余不和膜上配基产生亲和作用的物质则随流动相通过膜流走。

改变条件，如洗脱液的组成、pH值、离子强度、温度等，使复合物产生解离，并将解离物收集起来，进一步处理。

将解离后的亲和膜进行洗涤、再生、平衡，以备下次分离操作时再用。

操作时除要选择适宜的加料速度和操作温度外，洗脱方式的选择、洗脱液的组成是分离成败的一个重要因素。正确洗脱会进一步提高分离的纯度。反之，甚至会使生物大分子变性失活。洗脱可分为特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱就是在洗脱液中加人对配基有更强亲和力的物质，将目标蛋白质置换下来。而改变缓冲溶液中的盐浓度、pH值、温度等则属于非特性洗脱。一般非特异性洗脱经济些，但会导致纯度下降。若所用的吸附特异性低，如使用基团特异性的配基，采用特性洗脱会提高最终产品的纯度 ^[3] 。

蛋白质亲和分离中常用的作用体系有抗原-单克隆抗体，激素-受体蛋白，核酸-核酸结合蛋白，酶-底物/产物/抑制剂/辅酶，免疫球蛋白-蛋白A/蛋白G，蛋白质-肝素/活性染料/过渡金属离子/肽段等。

已报道的亲和膜应用实例有很多。例如，陈欢林、李静等采用低温氧或氨等离子体法改性聚丙烯中空纤维微孔膜，使膜表面产生了-OH、-COOH和C=O等极性基团，制备了Fe、Ni、Cu、Zn等金属离子螯合亲和膜，用于溶菌酶的分离，结果表明，Ni、Cu螯合膜对溶菌酶有较高的吸附量，在20 min和68 W的最佳条件下，制成的Cu离子膜对溶菌酶的平衡吸附量为8μg/cm2。螯合过程中采用氯化物盐溶液制得的膜比采用硫酸盐溶液制得的膜平衡吸附量要高。吸-脱附量衰减的问题可采用补充螯合离子的方法解决。美国Pall公司对聚酰胺微孔滤膜(孔径0.2μm)进行了化学改性，在膜上键合了含氨基的活性染料配基，并固载了单克隆或多克隆IgG免疫球蛋白，所获得的IgG纯度更高些。Millipore公司已研制成功含蛋白A的中空纤维膜分离器，可用作单克隆抗体的化。Amerace公司研制了一种聚乙烯醇和硅胶共混的亲和膜，在直径为47 mm的碟式膜上可结合20 mg的牛血清蛋白。

（1）以高分子膜材料为载体，极大地改善了蛋白质向配基的传质。当溶液透过膜时，溶液中的目标蛋白质能和配基很快结合，充分利用了亲和吸附快速、高效的特点，分离周期很短。对于大规模蛋白质分离来说，分离周期越短，原料的处理量越大，同时价格昂贵的配基的利用率也越高；

（2）亲和膜具有良好的流体通透性和机械稳定性，可在高流速下操作，设备操作压降低，易于放大；

（3）由于亲和膜具有良好的流体通透性和机械稳定性，操作流速高，洗脱时间短。对于解离常数较小的亲和系统（如抗原一抗体、激素一激素受体），可有效地保护配基和蛋白质的生物活性 ^[4] 。

亲和膜是一新型分离方法，是目前分离技术研究的热点之一。但是，与传统的凝胶色谱柱相比，亲和膜的吸附容量还不是太大，而且制造成本也较高。然而，随着制膜技术的发展、新型配基的开发和配基偶联技术的不断完善，亲和膜在大规模蛋白质（特别是基因工程蛋白质）分离纯化方面必将发挥越来越大的作用。