熔解曲线

总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变与温度作图，在扩增产物的只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没有必要，因为熔解曲线是由于染料法的特异性差，所以通过熔解曲线考察扩增产物是否是目标产物，与电泳的其中的一个目的相同，但熔解曲线毕竟是数学推导，并且结果中包含了仪器的误差。

分析real time PCR 结果的特异性：出现单峰说明扩增产物特异性好，出现杂峰特异性差，存在非特异性扩增，如引物二聚体等。一般是用SYBR Green作为荧光染料的时候使用，因为SYBR Green染料是非特异的染料，只要有扩增，染料就可以镶嵌在双链中发出荧光。做溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我们需要的产物。如果溶解曲线做出来只有单峰，且出峰位置是你的退火温度，那么这个是你的产物发出的荧光，实验结果有效。