组织原位杂交

用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针操作的长度以100-400nt为宜，过长则杂交率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16-30 nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交优选探针。

　　探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最为常用，3H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低，35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好，而32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。

　　原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要，去除蛋白质的方法是，用0.2mol/L HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水。原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。

RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究;

②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测;

③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;

④基因在染色体上的定位;

⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等;

⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。