体外转录

转录模板必须满足：

1. 在基因组全长克隆过程中，在正向引物5/ 端添加T7启动子序列；

2. 以T7启动子作为体外转录启动子，在启动子后面靶位序列连续带有3个G,转录效率最 高；

3. 在正向引物5/端添加一个帽子G,有利于提高体外转录RNA分子的侵染活性。

1. 提取cDNA质粒；

2. 线性化质粒：（利用单一的酶切位点线性化有利于转录）

3. 纯化质粒：（尽量避免RNase污染） ① 加等体积的Tris-苯酚：氯仿（1:1）到100μL限制内切酶消化体系，涡旋振荡20s, 13000g离心5min; ②上清转移，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M的醋酸钠（pH5.2），-20℃放置不少于2h或过夜放置; ③DNA质粒13000g离心5min ,并且用20μL H2O重悬，放于-20℃。

4. 体外转录：（根据以下组成配制反应液，轻轻混匀）

10*basal reaction buffer

2μL 5*accelerator solution

4μL 25mM rNTPs mixture

4.5μL RNase Inhibitor

0.5μL Template DNA

100ng-1μg Thermo T7 RNA polymerase

1μL Nuclease-free water

up to 20μL Total volume 20μL

5. 在37℃-42℃下放置2小时。

6. 转录产物可通过1%非变性琼脂糖来检测：取产物1μL,160V电压，结果应为两条带， 上为DNA模板，下为RNA 产物。

注意： 1. 模板DNA（环状或线型）：必须具有T7启动子位点。同时，模板应为RNase-free级。在 质粒提取过程中如使用了RNase,必须通过苯酚·氯仿处理等方法除去RNase。