小干扰RNA

小干扰RNA（siRNA），有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰（RNAi）途径内操作。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。

siRNA由双链RNA (double strand RNA， dsRNA) 在细胞内被RNase III (如Dicer) 切割成21～25bp大小的双链RNA。dsRNA可以是外源的， 如病毒RNA复制中间体或人工导入的dsRNA;也可以是内源的， 如细胞中单链RNA在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形成的dsRNA 。^[1]

siRNA最早是由英国的大卫·包孔博（David Baulcombe）团队发现，是植物中的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）现象的一部分，其研究结果发表于《科学》。2001年，汤玛士·涂许尔（Thomas Tuschl）团队发现合成的siRNA，可诱导哺乳动物体内的RNAi作用，结果发表于《科学》。这项发现引发了利用可控制的RNAi，来进行生物医学研究与药物开发的方法。

经由siRNA传达的RNA干扰机制

siRNA具有明确定义的结构：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）双链RNA（dsRNA）和具有两个突出核苷酸的羟基化3'末端。该切酶酶催化生产的siRNA由长的dsRNA和小发夹RNA。siRNA也可以通过转染引入细胞。由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。

siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，图示如下：

每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端。此结构是利用一种称为dicer的酶处理而得，这种酶可以将较长的双股RNA或小发夹RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性，来对已知序列的基因进行标定，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。

1.长dsRNA（可来自发夹，互补RNA和RNA依赖性RNA聚合酶）被称为Dicer的内切核糖核酸酶切割。Dicer切割长dsRNA以形成短干扰RNA或siRNA;这使得分子能够形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。

2.一旦siRNA进入细胞，它就会被整合到其他蛋白质中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC复合物的一部分，siRNA就展开以形成单链siRNA。

4.由于其在5'末端的碱基配对而在热力学上较不稳定的链被选择作为RISC复合物的一部分。

5.作为RISC复合物一部分的单链siRNA现在可以扫描并找到互补的mRNA

6.一旦单链siRNA（RISC复合物的一部分）与其靶mRNA结合，它就会诱导mRNA切割。

7.现在切割mRNA并被细胞识别为异常。这导致mRNA的降解，并且反过来不将mRNA翻译成氨基酸然后转化为蛋白质。从而沉默编码该mRNA的基因。

siRNA也类似于miRNA，然而，miRNA来自较短的茎环RNA产物，通常通过抑制翻译来沉默基因，并且具有更广泛的作用特异性，而siRNA通常通过在翻译前切割mRNA而起作用，并且具有100%的互补性，因此目标特异性非常严格。^[2]

通过转染外源siRNA进行的基因敲低通常是不令人满意的，因为该效应仅是短暂的，特别是在快速分裂的细胞中。这可以通过产生siRNA的表达载体来克服。修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环。得到的转录物是短发夹RNA（shRNA），其可以通过Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的转录盒使用RNA聚合酶III启动子（例如，U6或H1）来指导小核RNA（snRNA）的转录（U6参与基因剪接; H1是RNase）人RNase P）的成分。理论上，所得的siRNA转录物然后由Dicer处理。

通过使用细胞挤压也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取决于其与RNA诱导的沉默复合物（RISC）的结合能力。双链体siRNA与RISC的结合之后是用内切核酸酶解开和切割有义链。然后剩余的反义链-RISC复合物可以与靶mRNA结合以启动转录沉默。

已经发现dsRNA还可以激活基因表达，这种机制被称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa。已经显示靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。使用合成的dsRNA在人细胞中证明RNAa，称为“小活化RNA”（saRNA）。目前尚不清楚RNAa是否在其他生物体中是保守的。

siRNA诱导的转录后基因沉默始于RNA诱导的沉默复合物（RISC）的组装。该复合物通过切割编码靶基因的mRNA分子来沉默某些基因表达。为了开始该过程，两条siRNA链中的一条（引导链）将被装载到RISC中，而另一条链即过客链被降解。某些Dicer酶可能负责将引导链加载到RISC中。然后，siRNA扫描并指导RISC到mRNA分子上完全互补的序列。认为mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi结构域催化。然后通过切割与siRNA残基10和11配对的靶核苷酸之间的磷酸二酯键精确切割mRNA分子，从5'端开始计数。这种切割导致mRNA片段被细胞核酸外切酶进一步降解。5'片段通过外来体从其3'末端降解，而3'片段从其5'末端通过5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割后靶mRNA链与RISC的解离允许更多的mRNA被沉默。这种解离过程很可能是由ATP水解驱动的外在因素促进的。

有时不会发生靶mRNA分子的切割。在一些情况下，磷酸二酯骨架的核酸内切裂解可以通过切割位点附近的siRNA和靶mRNA的错配来抑制。其他时候，即使靶mRNA和siRNA完全配对，RISC的Argonaute蛋白也缺乏内切核酸酶活性。在这种情况下，基因表达将被miRNA诱导机制沉默。

Ping-Pong方法的简化版本，涉及蛋白质Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA负责转座子的沉默，而不是siRNAs。

近年来，RNAi技术在病毒感染性疾病治疗方面的应用已受到极大关注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等治疗中的应用研究最为活跃。目前，在siRNA抗AIDS的研究中，针对HIV结构蛋白基因及长末端重复序列（longterminal repeat，LTR）的SiRNA可以控制病毒复制；针对宿主细胞HIV受体CD4基因的siRNA可有效控制病毒进入宿主细胞，抑制病毒的感染过程。但CD4是人体正常免疫功能不可缺少的分子，它的表达抑制势必影响正常的免疫功能，由此设想针对CCR5、CCR4等共同受体设计siRNA，并正在试验中。另外在抗病毒治疗中，分别以丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒等基因组的编码区或非编码区为靶点设计的siRNA均取得了令人欣喜的体外抑制作用，但利用动物实验模型验证siRNA体内清除病毒的效果需进一步研究。^[1]

虽然RNAi有望成为抗病毒治疗的有效工具，但病毒株靶基因的高度突变或碱基丢失，如HIV和流感病毒，成为设计siRNA时必须考虑的问题。另外一种称为病毒抑制子蛋白的发现使研究人员对RNAi的抗病毒效应有了更深的认识，研究发现这种病毒抑制子由病毒基因组编码产生，最初在植物中发现，目前有报道别的真核生物中也存在，其与RNA干扰装置竞争性的结合，通过阻断siRNA的加工或干扰信号的传递等途径抑制RNA干扰，从而降低其抗病毒的效应。^[1]

针对上述影响因素，在RNAi抗病毒的治疗应用中，（1）靶序列的选择最好是针对病毒的保守序列，以减少病毒变异的影响。（2）设计针对不同靶序列的多种SiRNA并联合作用，以减少病毒逃逸的产生。（3）针对病毒进入细胞或病毒复制相关的宿主基因设计siRNA，如HIV受体CD4、CCR5等，这样即使病毒高度变异，其逃逸RNA干扰的几率也会大大降低。（4）针对病毒抑制子设计siRNA，可在一定程度上减少或避免病毒抑制子的产生，并且随着对RNA干扰的深入研究，将会有越来越多的相关报道。综上所述，RNAi在抗病毒治疗应用方面虽取得很大的突破，但其应用于临床还有待更深的研究。^[1]