载脂蛋白E

载脂蛋白E(Apo E)主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中, 正常人血浆Apo E浓度为0.03～0.05g/L。Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。

载脂蛋白E结构示意图载脂蛋白E是一种富含精氨酸的碱性蛋白，人ApoE是由299个氨基酸残基组成，分子量为34145D，含32个Arg和12个Lys存在于血浆的CM、VLDL及其残粒和β-VLDL中均含有ApoE，一部分ApoE在血液中与ApoAⅡ形成复合体。

Shore于1973年首先发现ApoE，Rall等于1982年测出ApoE的蛋白质一级结构，其后Taylor建立ApoE的cDNA序列，Breslow 和Zannis首先测出ApoE有3个等位基因异构体以及基因在染色体上的定位。据推算和测定，在介质中ApoE有62%的α-螺旋，9%的β-片层，11%的β-转角和18%无规则线团。ApoE分子可以被凝血酶水解为二个区域，N-端区(1～191)为22kD的可溶性球蛋白，此区域较稳定，该片段的136～158位肽段为受体结合位点，富含碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，也属于肝素结合区。此片段为一个反平行的四螺旋束，是α-螺旋蛋白的一般折叠方式。C端区(216～299)分子量为10kD，螺旋程度很高，不稳定，是与脂蛋白的结合区。用截去了末端的变异体及合成多肽片段进行ApoE羧基末端的检测表明，191残基以外羧基端存在三个螺旋，其中两个为A型(203～223和225～266)，第三个(268～289)为一种G型螺旋。与脂类或不同的脂质微粒或二甲基磷脂酰胆碱结合的结果说明，G螺旋和第二螺旋的末端在脂质连结，在ApoE的四聚体化过程中起重要的作用。更精确地说是263～286片段可能在脂连结ApoE与VLDL的结合中起有关键作用。ApoE主要由肝脏合成，近年来发现脑，肾，骨骼，肾上腺及巨噬细胞也能合成。

ApoE生理功能有：①是LDL受体的配体，也是肝细胞CM残粒受体的配体，它与脂蛋白代谢有密切相关性；②ApoE具有多态性，多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；③参与激活水解脂肪的酶类，参与免疫调节及神经组织的再生。

人类ApoE主要在肝脏和脑组织合成，在其他组织包括单核细胞（含巨噬细胞）也有合成能力。人的肾上腺、卵巢颗粒细胞也能合成ApoE。脑中ApoE的mRNA表达总量是肝脏的1/3，星形细胞是其主要合成部位。脑中生成的ApoE的作用可能是使细胞内的脂类重新分配而保持脑环境中的胆固醇平衡。脑肿瘤中发现有高浓度的ApoE，推断它可能作为神经胶质细胞瘤的标记。

人ApoE改变位置Utermann等于1975年首先观察到ApoE多态性，利用等电聚焦电泳和SDS-PAGE可以确认ApoE的多态性，其后又被直接检测的cDNA序列所证实。ApoE有三种构体（isoform）即E2、E3和E4。有的人只含有一种主要异构体，即为纯合子；有人可含两种主要异构体，即为杂合子。由此可见，人群中可有六种不同的表型（phenotype）。

等电聚焦检测的ApoE表型各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，无论在形态构造或生理机能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity），但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性，生物体所具有的遗传性状称为表型或表现型（phenotype），生物所具有的特异基因成分称为基因型（genotype）。表型是基因型与环境因素相互作用的结果。遗传物质是相对稳定的，但又是可变的，遗传物质的变化以及由其所引起表型的改变，称为突变（mutation）。遗传物质的突变包括染色体畸变和基因突变。基因突变是染色体中某一点上发生化学改变，所以又称为点突变（point mutation）。基因结构和遗传表型的研究是深入了解脂蛋白代谢缺陷症的分子生物学基础，逆向遗传学方法（reversegenetic approach）则使其有可能在蛋白质水平系统地分析结构和功能的关系。现已采用一个特定的cDNA探针从基因库中筛选所需要的基因进行cDNA克隆，测定其核苷酸序列，然后从核苷酸序列推断蛋白质氨基酸序列。目前已分离出许多与动脉粥样硬化有关的脂蛋白的cDNA克隆，并将其蛋白质一级结构的氨基酸排列顺序和基因的核苷酸顺序测出。现已查明，ApoAⅠ,ApoⅣ,ApoE, ApoB, ApoCⅡ和Apo（a）都存在着异构体，也就是说存在着各种不同的表型或基因型，并可分别从蛋白质水平和核酸水平进行分型。

ApoE基因PCR产物HhaⅠ酶切后RFLP图谱Zannis于1981年根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子（E2/2，E3/3，E4/4）和三种杂合子（E2/3，E2/4，E3/4）共六种常见表型，另外还有极少见的异构体。一般认为，次要异构体是由主要异构体翻译后，经唾液酸糖化修饰后转变而来。ApoE3/3型又称野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸（Arg）和半胱氨酸（Cys）的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体，自然人群中，基因频率ε3分布最高，ApoE3/3表型分布约70%。

由于ApoE多态性具有生物学重要性，对ApoE多态性的研究是目前医学的热门话题。ApoE表型和基因型的检测方法很多，多年来先后采用等电聚焦电泳和基因分析术进行检测。目前从基因水平研究ApoE基因型显然优于其蛋白表型，因为ApoE翻译后修饰会影响蛋白分析。

人群中ApoE多态性存在种族变异，不同人群中ApoE基因型高度不同。欧洲人ε4等位基因频率从北到南呈下降趋势的分布。亚洲人ε4频率低，相比之下，非洲人及巴布比亚和新几内亚ε4频率高。

由于早期观察到ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血症病人未在成年即患冠心病，从此，对ApoE多态性进行了广泛研究，许多证据认为，ApoE多态性是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因。大量人群调查发现ε4等位基因的一般作用是可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化，相反，ε2等位基因的一般作用是降低胆固醇浓度，其降低效应是ε4升高胆固醇的2～3倍。ApoE等位基因变异还与血浆ApoB浓度、甘油三酯及血管收缩压有关。Menzel等认为ε2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用，经临床研究发现，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影证明有动脉粥样硬化者，比其对照组的ε4等位基因频率高。ApoE4/3杂合子比E3/2和E3/3基因型者发生心肌梗塞年龄早。ApoE多态性变异还与肾病综合症、糖尿病有关。

值得重视的是ApoE多态性与老年性痴呆病（AD）的关系。1993年，Rose研究发现，晚发性家族型AD病人ε4频率增多，还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽Aβ的亲和力很高。其后陆续发现AD病人中携带ε4等位基因者占46.2%，而对照组占13.2%。还发现携带二个ε4等位基因的研究对象比携带一个ε4的研究对象发生AD年龄早，比不携带ε4等位基因的研究对象发生AD年龄更早，1994年，Schacher等人相继报道百岁老人普遍携带ε2基因。这一发现使ApoE多态性和研究向前迈出了一大步。有报道高老年人携带ε2等位基因数量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不仅可以保护人们免患AD，而且还与长寿有关。ApoE多态性与AD的关系，目前的研究主要集中在脑代谢中与Aβ或Tau蛋白以及神经元生长和分枝等有关。

总之，在研究高脂血症评定心脑血管疾病的危险因素方面，以ApoE多态性为手段进行研究有重要的临床意义。有学者认为，基因型的“坏”（ε4）和“好”（ε2）的等位基因之间的平衡，可作为基因分析应用于医学检验领域，协助临床疾病的诊断。

ApoE是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白（Mr34200），主要存在于CM、VLDL和HDL中。 1975年Utermann等将脱脂的VLDL进行IEF电泳时，首先提示ApoE多态性的存在。ApoE多态性的产生是由于其一个遗传位点上的3个主要等位基因ε2、ε3、ε4所编码的3种主要ApoE异构体E2、E3、E4之间单个氨基酸替换及其与四种受体的亲和力不同。人群中有6种不同的ApoE表型：三种纯合子（E2/2、E3/3、E4/4）和三种杂合子（E3/2、E4/2、E4/3）。ApoE3是人群中最常出现的形式，常被称为“野生型”（Wild-type），其多肽链112位是半胱氨酸Cys，158位是精氨酸Arg。

ApoE多态性主要由其基因多态性所决定，另外也受到翻译后化学修饰的影响。许多研究资料表明，ApoE多态性不仅CHD、AS的发生发展及危险性密切相关，而且与Alzheimer病（AD）发生有关联，这些领域的研究已引起人们广泛关注与浓厚兴趣。许多临床及研究实验室对比进行了广泛的研究，依据被检查病人的类型，已建立了几种快速准确测定ApoE表型的方法。

ApoE表型检测即可以以VLDL为样品，又可以直接以血清（或血浆）为样品，通过IEF电泳分析、双向PAGE或结合免疫印迹法进行测定。

等电聚焦（IEF）

由于三种主要ApoE异构体E2、E3和E4的等电点（pⅠ）分别为5.89、6.02和6.68，E4比E3多一个正电荷，而E2比E3少一个正电荷。因此，可应用1EF检测这些异构体间电荷差异而确定不同ApoE表型。传统ApoE表型检测方法多采用超速离心法或化学沉淀法分离VLDL，脱脂后进行IEF，然后进行染色分析。这种方法需要血清量较多，昂贵、费时，又需要大型设备，不适合大规模研究。ApoE异构体之间染色程度之间差异及电泳过程中泳动距离的变异性也造成结果的不稳定性。

免疫印迹法（immunoblotting）

血清脱脂后，经IEF电泳将ApoE与其他蛋白质分离，然后将凝胶中蛋白质转移到硝酸纤维素（NC）膜上，用抗ApoE抗体作为一抗进行免疫印迹反应或采用直接的免疫固定法，即可灵敏而特异地显示出ApoE区带的位置，从而确定ApoE表型。此方法利用抗原-抗体的特异反应，排除了血清其他蛋白质的干扰，不需超速离心分离VLDL，血清用量少，是国内外实验室检测ApoE表型常用的方法之一。但此类方法亦存在一些缺点，如对于存在与普遍异构体具有相同电荷的罕见异构体标本，或在糖尿病等病理状态时，由于转录后修饰引起蛋白质变化的标本检测时，就会给出错误的结果。

双相电泳（two-dimensional electrophoresis）

第一相应用IEF电泳将等电点不同的蛋白质分离；第二相根据蛋白质分子量不同及浓度的差异，应用SDS-PAGE进行分离，由此确定ApoE表型。此技术能解决IEF遇到的一些转录后修饰的问题，临床标本用量也很少，并且可以同时进行定性和定量分析，但由于成本昂贵而且费时，有时也难以清晰地分辨表型，故临床上应用较少。

本法以VLDL为测定样品。首先利用超速离心机自血清中分离VLDL，一方面可去除血清杂蛋白的干扰，另一方面也可达到富集ApoE的作用，因ApoE主要存在于VLDL。

电泳仪，垂直板式电泳槽，超速离心机，光密度计，大培养皿；主要试剂有：①1.00g/ml NaBr与1.20g/ml NaBr溶液；②脱脂液为乙醇/乙醚混合液（3：1,V/V）；③样品溶解液为0.01mol/L Tris-HCl,pH8.2,内含1%SDS，5%β-巯基乙醇及13%蔗糖；④凝胶贮存液；丙烯酰胺（Acr）30g，NN’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）1.2g，加水至100ml；⑤电极缓冲液：0.01mol/L H3PO4（阳极），0.02mol/L NaCl（阴极）；⑥凝胶应用液：PAG浓度为7.5%，内含1.6%两性电解质载体(Ampholyte,pH4.0～6.5,Pharmacia)；⑦0.2% CBBG250染色液；⑧脱色液：甲醇/水/乙酸溶液（5：5：1，V/V）。

VLDL的IEF-PAGE图①人血清VLDL的分离；取血清3.0ml，加入固体NaBr使其密度增加至1.30g/ml。在BeckmanL8-80离心机Ti80转头离心管中依次加入密度为1.00g/ml,1.20g/ml的NaBr溶液和1.30g/ml的血清样品，形成1.00～1.30g/ml的不连续密度梯度。10℃，70000r/min超速离心2h，离心后在管顶层可见白色乳状液体，此即为VLDL，小心收集0.3～0.5ml并转移至已准备好的脱脂管内脱脂。②VLDL的脱脂：按Scanu(1971)法进行。先用3：1（V/V）乙醇/乙醚混合液在-20℃脱脂两次，每次9～12h，继用乙醚脱脂1次，2h。每次脱脂后在-15℃离心收集沉淀，3000r/min,15min。末次离心后在管中加入0.01mol/L Tris-HCl,pH8.2，内含1%SDS，2%两性电解质载体，5%β-巯基乙醇及13%蔗糖的溶液60μl，并在室温下孵育30min，最后用氮气吹尽残存的乙醚，此即为IEF电泳的样品。③IEF电泳：按Menzel等（1983）法进行。垂直板PAG浓度为7.5%，内含1.6%pH4.0～6.5的两性电解质载体。电泳凝胶用0.2%CBBG250染色。脱色后至图像清晰后照像扫描。④ApoE表型判定：根据电泳图谱，依据E2、E3、E4各区带光密度比例确认ApoE各表型，如图和表所示。ApoE表型的鉴定

由于ApoE即有主要异构体，又有次要异构体，有时使表型确定较为困难。一般情况下，应用此法较易确定ApoE纯合子表型，但对于某些杂合子表型的判定要慎重，往往要在色带经过光密度扫描以后，根据两条色带颜色深浅之比才能最后定论。如仍难以确定时，可用唾液酸酶处理VLDL，使次要异构体减少或消失，而有利于表型的判定。

由于IEF法需大型设备，工作量较大，极大地限制了该法的临床应用。免疫印迹法为目前检测ApoE表型最常用方法。此法直接用血清（或血浆）作为样品，脱脂后进行IEF电泳，然后用特异性多克隆或单克隆抗体进行免疫印迹反应，根据黑色后图谱即可确定ApoE表型。此法比IEF法更省时、简便、准确。

电泳仪，垂直板式电泳槽，转移电泳槽，NC膜；主要试剂有：⑴3：1（V/V）乙醚脱脂液；⑵样品溶解液；0.01mol/L Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素；⑶两性电解质（Ampholine,pH4～6,LKB产品）；⑷丙烯酰胺（Acr）、N-N'甲叉双丙烯酰胺（Bis），Serva产品；⑸TEMED（Sigma产品）；⑹电泳缓冲液：1mol/L NaOH,1mol/L H3PO4；⑺转移电泳缓冲液：含20%甲醇，39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris和0.0375%SDS；⑻洗涤液（TPBS）含0.05%吐温-20，0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4；⑼封闭液：含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS；⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清；⑾HRP标记的兔抗羊IgG：⑿4-氯-1-萘酚（Sigma产品）。

（1）样品处理：抽取空腹血1～2ml，分离血清。取血清10μ置于预冷乙醇/乙醚（3：1）脱脂液中-20℃脱10h以上，离心（2500r/min）15min，弃上清后的加等量预冷的无水乙醚继续脱脂0.5h，再次离心，将沉淀样品用氮气吹干或抽真空使残余乙醚挥发；（2）IEF电泳：电泳前将样本溶解在100μl溶解液中（0.01mol/L Tris,pH8.6,内含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素），放置37℃，1h。PAG凝胶浓度为5%，内含尿素（8mol/L），2%Ampholine,0.025%过硫酸胺（AP）及0.033%TEMED。电极液：阴极为1mol/LNaOH，阳极为1mol/LH3PO4。每份样品加样20μl，IEF条件初为300V，0.5h,然后调至700V，电泳5h。或1000V预冰30min（10℃）后，关电源，在靠阴极处放上IEF加样箔，每一空内加样后，继续电泳2h30min；（3）免疫印迹：转移电泳条件18V/cm，按转移电泳槽要求将凝胶上的蛋白电泳转移到NC膜上。5h后取出NC膜，放入封闭液内，室温过夜。用TPBS洗3次，然后用羊抗人ApoE抗血清（1：2000TPBS稀释）室温孵育6h。倾去液体，充分洗涤后，加入HRP标记的兔抗羊IgG（1：200）室温孵育2h。用PBS洗膜3次，每次10min。称取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇（-20℃）中，放入20mlPBS，加入10μ130%H2O2，放入已洗净的NC膜，缓缓摇动至蛋白带显出，蒸馏水洗后，晾干，暗处保存。