酵母人工染色体

在 YAC载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。

YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：

（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

（autonomously replication sequences，ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。

YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图3-26是 pYAC4 的遗传结构图，当用BamHⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。

YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失（deletion） 和基因重排（rearrangement） 的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。最后， YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。

据英国《新科学家》杂志网站9月15日(北京时间)报道，美国生物学家人工合成出两个染色体片断并将其放入一个活酵母菌体内，酵母菌仍能正常存活，未出现明显异常。科学家们计划在接下来的5年内用人造基因组取代酵母菌的所有基因组，让其进化出新菌株。

约翰霍普金斯大学医学院的生物学家杰夫·博伊科领导的科研团队不仅从头设计并制造出了新的基因组，也找到了“拼凑”这些基因组以制造出新染色体的方法。此前曾有研究人员人工合成过一种细菌的基因组，但细菌属于原核生物，而酵母属于更高级的真核生物。本次研究是世界上首次成功合成真核生物的部分基因组，标志人工合成生物基因组的研究又迈出了重要步伐。

酵母菌有16个染色体，所有染色体都已被排序。博伊科团队首先用已知的染色体序列做起点，在计算机上设计出新序列，随后剥去了所有不为蛋白质编码的不必要基因，接着在所有不必要基因的终端添加了标记物，标记物可在不杀死酵母菌的情况下被修改或删除，而一种名为Cre的酶会攻击这些标记并在标记点之间交换基因。最终，博伊科团队在实验室制造出了两个新的染色体片断，并将其插入一个活酵母菌体内，用其替代9号染色体和6号染色体的一部分。

博伊科打算继续使用这种基因交换技术改变酵母菌的其他染色体，因为该方法只针对非必需基因，并不会干扰其内部结构。在很大程度上，科学家们能制造出健康的酵母菌。这种基因交换技术能测试不同的基因排列对酵母菌的影响，比如用来探索基因组被删去多少后生物仍能存活，或是探索基因组被打乱、改变到什么程度才会产生新物种。“取出一个酵母菌基因并将其插入基因组中的某处，你有可能得到一个健康的酵母菌，或许我们会发现基因组结构内还有些隐藏的规则。”博伊科说。

除了用于制造面包和啤酒，普通的酵母菌也已被用来制造疫苗。科学家们也制造出了能用于合成生物燃料的转基因酵母菌。通过这种新的人工合成基因技术，科学家能够得到不同属性的酵母，比如生长率、对药物敏感程度、温度敏感性都不同的酵母，用于不同目的的研究。

1879年德国生物学家弗莱明（F1eming·w ）把细胞核中的丝状和粒状的物质，用染料染红，观察发现这些物质平时散漫地分布在细胞核中，当细胞分裂时，散漫的染色物体便浓缩，形成一定数目和一定形状的条状物，到分裂完成时，条状物又疏松为散漫状 。

1883年美国学者提出了遗传基因在染色体上的学说。

1888年正式被命名为染色体。

1902年，美国生物学家萨顿和鲍维里通过观察细胞的减数分裂时又发现染色体是成对的，并推测基因位于染色体上。

1956年庄有兴等人明确了人类每个细胞有46条染色体，46条染色体按其大小、形态配成23对，第一对到第二十二对叫做常染色体，为男女共有，第二十三对是一对性染色体。

1928年摩尔根证实了染色体是遗传基因的载体，从而获得了生理医学诺贝尔奖。

1953年4月《自然》杂志刊登了美国的沃森和英国的克里克在英国剑桥大学合作的研究成果：DNA双螺旋结构的分子模型，被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现。