液质联用

　　色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物，对无 紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。

　　据统计，已知化合物中约80%的化合物是 亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及 生物大分子，这些化合物的分析不适宜用 气相色谱分析，只能依靠液相色谱。如果能成功地将液相与质谱联接使用，这一技术将在生物、医药、化工和环境等领域大有应用前景。为达到这一目的需要一个起“接口”作用的装置将液相与质谱联接起来。

　　这个接口要解决三个主要的问题：

　　（1）液相色谱中使用的流速较大，而质谱需要一个 高真空环境工作；

　　（2）要从流动相中提供足够的离子供质谱分析；

　　（3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染。

　　近年来，液相色谱-质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越来越广泛，且随着现代化高新技术的不断发展及液相色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技术必将在未来几年不断发展且发挥越来越重要的作用。

　　HPLC-MS除了可以分析 气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强 极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：

　　①分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；

　　②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离开，但通过MS的特征离子 质量色谱图也能分别给出它们各自的 色谱图来进行定性定量；

　　③ 定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；

　　④ 检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个 数量级以上；

　　⑤分析时间快，HPLC-MS使用的 液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；

　　⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。

　　 接口技术的发展历程

　　自20 世纪70 年代初，人们开始致力于液-质联用接口技术的研究。在开始的20 年中处于缓慢的发展阶段，研制出了许多种联用接口，但均没有应用于商业化生产。直到 大气压离子化（atmospheric-pressure ionization, API）接口技术的问世，液-质联用才得到迅猛发展，广泛应用于实验室内分析和应用领域。

　　质 谱图

　　液-质联用接口技术主要是沿着三个分支发展的：

　　（1）流动相进入质谱直接离子化，形成了连续流动快 原子轰击（continuous-flow fast atom bombarment, CFFAB）技术等；

　　（2）流动相雾化后除去溶剂，分析物蒸发后再离子化，形成了“ 传送带式”接口（moving-belt interface）和离子束接口（particle-beam interface）等；

　　（3）流动相雾化后形成的小 液滴解 溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形成了 热喷雾接口（thermo spray interface）、大气压化学离子化（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）和 电喷雾离子化（electrospray ionization, ESI）技术等。有关液相质谱的接口技术和LC-MS 技术的发展，Niessen 曾经进行了较为详细的综述。

　　1 液体直接导入接口

　　1972 年，Tal’roze 等人提出了直接将 色谱柱出口导入质谱的思想，当时称之为 毛细管入口界面。相继有许多研究组开展这方面的研究，在1980 年这种液质接口已经用于商业化生产。为了避免非挥发溶剂的污染，Melera 使用一个小的 横隔膜对这一接口进行了改进，研制成了液体直接导入接口（direct liquid introduction interface）技术。该接口是将液相色谱的流动相沿着进样杆流动，然后通过一个直径为3-5µm 的针孔，使液体射入 质谱计的CI 离子源中。采用传统的CI 离子源可以很容易地把色谱与质谱计相连或脱开。

　　液体直接导入接口的优点是：接口简单，造价低廉，可将非挥发性和热不稳定性的化合物温和地转化成 气态，样品以溶液状态进入质谱形成了CI 条件，可得到分子量信息。缺点是：分流过程中需要减少大量的流动相，使用的隔膜经常堵塞。

　　 质谱仪

　　2 连续流动快原子轰击

　　1985 和1986 年，快原子轰击（FAB）和连续流动快原子轰击（CFFAB）接口技术相继问世，并随后投入了商业化生产。快原子轰击是用加速的中性原子（快原子）撞击以 甘油调和后涂在金属表面的有机物（“靶面”），导致这些 有机化合物的 电离。分析物经中性原子的撞击获取足够的动能以离子或中性分子的形式由靶面逸出，进入气相，产生的离子一般是 准分子离子。在此基础上发展的连续流动快原子轰击技术，得到更广泛的应用。其甘油的浓度在2%-5%之间，比静态的FAB使用的甘油量少，且测定过程中“靶面”得到不断更新，其化学物理性质变化很小，同时经色谱分离后的共存物质不会同时出现在“靶面”上，因此大大降低了噪声，信噪比提高， 定量分析的重现性也得到改善。

　　连续流动快原子轰击接口的优点：是一种“软”离子化技术，适用于分析热不稳定、难以 汽化的化合物，尤其是对肽类和蛋白质的分析在当时是最有效的。缺点是：只能在较低的流量下工作，一般小于5µl/min，大大限制了液相柱的分离效果，流动相中使用的甘油会使离子源很快变脏，同时容易堵塞毛细管，混合物样品中共存物质的干扰也会抑制分析物的离子化，降低灵敏度。

　　3 “传送带式”接口

　　1977 年，世界上第一台商业化生产的液-质联用接口就是使用传送带式（moving-belt, MB）技术，是由Mac Fadden 等人对前人研制的传送线式接口技术的改进。该接口是液相的流动相不停地由传送带送入质谱离子源，传送带可根据流动相的组成进行调整。在传送过程中，样品 闪蒸解离进入离子源，在进入离子源前通过两个不同的泵和 真空阀在减压条件下加热除去流动相，可以连接EI、CI 或FAB。在分析未知化合物时，可连接EI 分析，获得的谱图可以在质谱数据库检索。分析大分子生物样品时，多选用FAB。在CI 条件下，当样品与CI 等离子体完全接触的状态下才可获得最佳结果。

　　传送带式接口的优点是：对挥发性溶剂的传送能力高达1.5ml/min，对纯水会减少至0.5ml/min；喷射装置与传送带表面呈45o 夹角时，可以改善色谱积分曲线；非挥发性 缓冲液可以从传送带上除去，可以使用非挥发性 缓冲溶液；对样品的收集率和富集率都较高。缺点是：传送带的 记忆效应不易消除，检测信号的 背景值较高，只能分析 热稳定性的化合物。

　　4 离子束接口

　　离子束接口（ particle-beam interface,PB ） 是从单分散 气溶胶界面（monodisperse aerosol generating interface for chromatography, MAGIC）发展来的。该接口将液相色谱的流动相在 常压下借助气动雾化产生气溶胶，气溶胶扩展进入加热的去溶剂室，此时待测分子通过一个动量 分离器与溶剂分离，然后经一根加热的传送管进入质谱。分析物粒子在离子源与热源室的内壁碰撞而分解，溶剂蒸发后释放出气态待测分子即可进行离子化。

　　离子束接口的优点是：分析范围比热喷雾接口更宽，将电离过程与溶剂分离过程分开，更适合于使用不同的流动相，不同的分析物质；主要用于分析非极性或中等极性，分子量小于1,000 的化合物，在药残、 药物代谢分析、化工方面曾有许多成功的实例分析。其缺点是：灵敏度变化范围大，线性响应的浓度范围较窄，两种化合物的协同洗脱会对响应产生不可预测的效应，使用高速 氦气造价太高，离子化手段仍然是电子轰击，不适于分析热不稳定的化合物。

　　5 热喷雾接口

　　热喷雾接口（thermo spray interface）是从20 世纪70 年代中期开始在美国 休斯顿大学实验室立项研究，旨在解决在液相和质谱之间传送1ml/min 流速 水溶液流动相的难题，可使用EI和CI两种离子化源。在最初的设计中非常复杂，直到1987 年后的五年内才得到突飞猛进的发展。该接口是将液相色谱的流动相通过一根电阻式加热毛细管进入一个加热的离子室，毛细管内径约0.1mm，比液体直接导入接口的取样孔大很多。毛细管的温度调节到溶剂部分蒸发的程度，产生蒸汽超声喷射，在含有水溶剂的情况下，喷射中含有夹带荷电 小液滴的雾状物。由于离子室是加热的，并由前级 真空泵预抽真空，当液滴经过离子源时继续蒸发变小，有效地增加了荷电液滴的 电场梯度。最终使其成为自由离子而从液滴表面释放出去，通过取样锥内的小孔离开热喷雾离子源。

　　热喷雾接口的优点是：可以减少进入质谱的溶剂量，对不挥发的分析物分子也可电离，可以接受的溶剂流量大致范围为0.5~2.5ml/min，但不允许有不挥发性缓冲溶液。缺点是：该接口技术的重现性较差，受溶剂成分、取样杆温度及离子源温度的影响；是一种 软电离技术，在谱图中只有 分子离子峰，碎片非常少；对分析物要求有一定的极性，流动相中要有一定量的水，对热稳定性差的化合物有明显的 分解作用。

　　6 电喷雾离子化技术

　　电喷雾（ESI）技术作为质谱的一种进 样方法起源于20 世纪60 年代末Dole等人的研究，直到1984 年Fenn 实验组对这一技术的研究取得了突破性进展。1985 年，将电喷雾进样与大气压离子源成功连接。1987 年，Bruins 等人发展了空气压辅助电喷雾接口，解决了流量限制问题，随后第一台商业化生产的带有API 源的液-质联用仪问世。ESI 的大发展主要源自于使用电喷雾离子化蛋白质的 多电荷离子在 四极杆仪器上分析大分子蛋白质，大大拓宽了分析化合物的分子量范围。

　　ESI 源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域，通过大气压离子化产生离子；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子 光学系统，该区域的离子随后进入 质量分析器。在ESI 中，离子的形成是分析物分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化过程是在 液态下完成的。液相色谱的流动相流入离子源，在 氮气流下汽化后进入 强电场区域，强电场形成的 库仑力使小液滴样品离子化，离子表面的液体借助于逆流加热的氮气分子进一步蒸发，使 分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。这些离子可能是单 电荷或多电荷，取决于分子中酸性或 碱性基团的体积和数量。

　　液相色谱图

　　电喷雾离子化技术的突出特点是：可以生成高度带电的离子而不发生碎裂，可将 质荷比降低到各种不同类型的质量分析器都能检测的程度，通过检测带电状态可计算离子的真实分子量，同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量。另外，ESI 可以很方便地与其它分离技术联接，如液相色谱、 毛细管电泳等，可方便地纯化样品用于质谱分析。因此在药残、药物代谢、蛋白质分析、 分子生物学研究等诸多方面得到广泛的应用。其主要优点是：离子化效率高；离子化模式多，正负离子模式均可以分析；对蛋白质的分析分子量测定范围高达105 以上；对热不稳定化合物能够产生高丰度的分子离子峰；可与大流量的液相联机使用；通过调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

　　7 大气压化学离子化技术

　　大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning 等人于20 世纪70 年代初发明的，直到20 世纪80 年代末才真正得到突飞猛进的发展，与ESI 源的发展基本上是同步的。但是APCI 技术不同于传统的 化学电离接口，它是借助于 电晕放电启动一系列 气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的流动相进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过 加热管时被汽化。在加热管端进行 电晕 尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态 分子碰撞，经过复杂的反应后生成准分子离子。然后经筛选 狭缝进入质谱计。整个电离过程是在大气压条件下完成的。

　　APCI 的优点是：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的 梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量级；液相色谱-大气压化学电离串联质谱成为精确、细致分析混合物结构信息的有效技术。

　　早在19世纪末，E.Goldstein在 低压放电实验中观察到 正电荷粒子，随后W.Wein发现正电荷 粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为 质谱的诞生提供了准备。

　　Joseph John Thomson

　　世界上第一台质谱仪于1912年由 英国 物理学家Joseph John Thomson（1906年 诺贝尔物理学奖获得者、 英国剑桥大学教授）研制成功；到20世纪20年代，质谱逐渐成为一种分析手段，被化学家采用；从40年代开始，质谱广泛用于 有机物质分析；1966年，M.S.B，Munson和F.H. Field报道了化学电离源（Chemical Ionization，CI），质谱第一次可以检测热不稳定的生物分子；到了80年代左右，随着快 原子轰击（FAB）、电喷雾（ESI）和 基质辅助激光解析（MALDI）等新“软电离”技术的出现，质谱能用于分析高 极性、难挥发和热不稳定 样品后， 生物质谱飞速发展，已成为现代科学前沿的热点之一。由于具有迅速、灵敏、准确的优点，并能进行 蛋白质序列分析和 翻译后修饰分析，生物质谱已经 无可争议地成为 蛋白质组学中分析与鉴定肽和蛋白质的最重要的手段。

　　 质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是 分离科学方法中的一项突破性进展。如用质谱法作为 气相色谱（GC）的 检测器已成为一项标准化GC 技术被广泛使用。由于GC-MS 不能分离不稳定和不挥发性物质，所以发展了 液相色谱（LC）与质谱法的联用技术。LC-MS可以同时检测糖肽的位置并且提供结构信息。1987年首次报道了 毛细管电泳（CE）与质谱的联用技术。CE-MS 在一次分析中可以同时得到迁移时间、分子量和碎片信息，因此它是LC-MS的补充。

　　在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高 特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱的发展对 基础科学研究、国防、航天以及其它工业、民用等诸多领域均有重要意义。

　　伴随着液-质联用接口技术的发展， 质谱仪器本身也在不断发展，出现了多种类型的质谱检测器。目前比较常用的质谱仪器有： 四极杆质谱仪、四极杆 离子阱质谱仪、 飞行时间质谱仪和 离子 回旋共振质谱仪等。

　　1 四极杆质谱分析仪

　　质谱仪

　　目前，四极杆质量滤器的应用仍然最为广泛。三级四极杆质谱仪的 选择反应监测（selected-reaction monitoring, SRM）模式适于进行常规的和高通量的生物分析。四极杆工艺的改进和强稳定性的射频（RF）大大提高了质谱的分辨率，分辨 质量数的宽度达到0.1Da，提高了分析化合物的选择性。随着对三级四极杆质谱中碰撞池的改进，出现了 高压线形加速碰撞池，提高了对传送离子的能力，降低了物质间的干扰，大大提高了对多组分生物化合物的分析能力。在所有的质谱分析仪中，四极杆质谱仪的定量分析结果的准确度和精密度最好。

　　2 四极杆 离子阱质谱分析仪

　　在阐明化合物的结构方面，三维的四极杆 离子阱得到广泛的应用。与此相关的革新主要有基质辅助 激光解吸离子化源、大气压基质辅助激光解吸离子化源、 红外多 光子光 离解技术的发展，以及使用离子阱分析碱性加合离子与金属 配位产物的研究。近些年，线形二维离子阱的生产，取得了突破性的进展。这种线形二维离子阱与三维离子阱一样可以对化合物做多级质谱分析，此外还可以积累更多的离子，提高了检测的灵敏度。在与线形加速碰撞池离子化源连接后，可大大提高灵敏度，避免小分子量碎片的干扰，得到更整洁、美观的色谱峰。

　　3 飞行时间质谱分析仪

　　随着基质辅助激光解吸离子化技术的出现和计算机的发展，飞行时间质谱仪在20 世纪90 年代得到快速发展。目前，最好的飞行时间质谱分析仪分辨率能够达到20,000Da，测得分子的质量数准确度非常高。飞行时间质谱仪在很大程度上取代了高分辨双聚焦磁扇分析仪，但其不能有效地利用选择离子监测模式进行分析。在高分辨质谱的选择离子监测 模式分析中仍然主要使用 双聚焦质谱仪。为了使用分辨率高的质谱分析化合物的二级 质谱图，人们尝试将飞行时间质谱与其它质谱串联使用，目前使用比较多的是四极杆-飞行时间 串联质谱仪，可以帮助我们更准确地了解化合物裂解后离子碎片的质量数。

　　4 傅立叶变换离子回旋共振分析仪

　　许多年以来，傅立叶变换离子回旋共振质谱（Fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR-MS）在气相离子-分子反应的基础研究中成为有效的手段。该质谱与ESI 离子源联接后被广泛地应用于 生物大分子的研究，能够充分发挥其高分辨率和准确度的优势。基于傅立叶变换离子回旋共振池内离子的四极激发，该质谱可以选择地累积非 共价键复杂化合物的离子，使其能够分析分子量非常大的生物大分子化合物，如分析分子量高达108Da 的大肠杆菌 噬菌体的T4 DNA，成为该 质谱仪发展的重要里程碑。该质谱仪通过 射频脉冲消除其它离子的干扰选择性地捕获目标离子到离子回旋共振池内，也能够进行多级质谱分析。当前又有许多新的离子裂解方法应用到 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪，如碰撞诱导裂解、激光致光裂解或红外多光子光裂解、表面诱导裂解、黑体 红外辐射裂解、 电子捕获裂解等，又进一步改善了这种质谱仪分析的性能。

　　除上面描述的常见的几种 接口技术和质谱仪之外，还有其它的一些产品不断问世。近十年来，人们在液-质联用技术的研究方面已经将研究的重点转移到研制适合某种分析领域的强优势的技术，并加速产品的商业化。总之，液-质联用分析技术的发展取决于液-质联用接口技术和质谱分析仪技术的共同发展。通过合适的接口将液相色谱与质谱仪联接，会获得具有特殊分析性能的液-质联用仪器，另外通过接口将质谱与质谱进行串联，可以弥补各种质谱仪的不足，达到取长补短，协同提高的效果。

　　 基体效应

　　1 基体效应的来源

　　LC-MS中的 基质效应现象最初在1993年被发现，当改变样品基质的种类和浓度时，待测物 电喷雾化质谱的 响应值降低了。美国FDA2001年出版的《生物分析方法验证准则》明确提出：在LC-MS分析方法开发和验证过程中需要对基质效应进行评价。基质效应是指样品中除了待测物以外的其他基质成分对待测物测定值的影响，它源自色谱分离过程中与被测物共流出的物质对被测物离子化过程的影响，共流出干扰物可分为内源性杂质和外源性杂质。内源性杂质是指样品提取过程中同时被提取出来的有机或无机分子，当这些物质在共提取液中浓度较高，并与目标化合物共流出 色谱柱进入离子源时，将严重影响目标化合物的离子化过程。外源性杂质通常易被人们忽视，但也会带来严重的基体效应。这些干扰物由样品前处理各步骤引入，文献报道的主要包括的聚合物残留、酞酸盐、 去污剂 降解产物、 离子对试剂、有机酸等离子交换 促进剂、缓冲盐或SPE 小柱材料及色谱柱 固定相释放的物质等。

　　2 基体效应的补偿

　　基体效应的存在会严重影响对待测物的定量准确度和精密度，且影响因素多变，很难被完全消除。近儿年来，致力于消除和补偿基质效应的研究逐渐增多，主要包括优化质谱条件，优化色谱分离体系，多步净化措施，使用 内标物定量，采用基质匹配 标准曲线定量，回声峰技术等。

　　随着联用技术的日趋完善，HPLC-MS逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行 蛋白质、 多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和 碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等，这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC-MS作为已经比较成熟的技术，目前己在生化分析、 天然产物分析、药物和保健食品分析以及 环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。

　　1 生化方面的分析中的应用

　　生物体内的蛋白质、肽和核酸，都以混合物状态出现，具有强 极性，难挥发性，又具有明显的热不稳定性，所以用GC-MS来分析 生物大分子存在困难，需要经过深度降解，并需对降解生物作各种复杂的衍生化处理。而HPLC能分析强极性、不易挥发、高分子量及对热不稳定的化合物；MS具有高灵敏度，能在复杂 基质中进行准确的化合物的优点，所以HPLC-MS作为生化分析的一个有力工具，正在得到日益的重视。研究人员利用HPLC-MS技术在生化方面己经有很多应用。

　　2 天然产物分析中的应用

　　利用HPLC-MS分析混合 样品，和其他方法相比具有高效快速，灵敏度高，只需品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易分离得到或在分离过程中易的组分。因此HPLC-MS技术为天然产物研究提供了一个高效、切实可行的分析途国内利用该技术在天然产物研究中已经有很多报道。如 李丽等利用 高效液相色 质谱联用技术研究了 朝鲜淫羊蕾中的 黄酮类化合物。

液质联用仪器

　　3 药物和保健食品分析中的应用

　　质谱作为 液相色谱的 检测器与紫外和 二极管阵列检测器相比较，兼有鉴定功能和灵敏度高的特点。所以近些年来HPLC-MS己经成为 药物分析方面的有利工具。近几年用HPLC-MS对各种药物尤其是 违禁药物及其 代谢产物的研究国内外有大量的文献报道，如尿中的 河豚毒素、 抗生素、 舒喘宁和血液中的 安非他明、奥美拉哇、罗呱卡因、 氨磺必利、 前列腺素EZ以及 爱滋病病毒等 痕量残留的分析。可以预测，随着对HPLC-MS研究的深入和该技术应用的普及，HPLC-MS技术将成为药物和保健食品中违禁 成分分析中发挥更大的作用。

　　4 环境分析中的应用

　　HPLC-MS己经在环境分析中有很多的应用，如环境样品中的抗生素、 多环芳烃、 多氯联苯、 酚类化合物、 农药残留等。尤其是近些年，农药残留问题一直是个热门话题。由于 农药正向高效和低毒方向发展，使农药的 环境影响和残留农药的检测方法发生了变化。由于目前低浓度、难挥发、热不稳定和强极性 农药分析方法并不是十分理想，因此发展高灵敏度的多残留可靠分析方法己成为 环境分析化学及农业化学家的重要战略目标。 高效液相色谱法弥补了 气相色谱法不宜分析难挥发， 热稳定性差的物质的缺陷，可以直接测定那些难以用GC分析的农药。但是常规检测器如紫外(UV)及二极管阵列(PAD)等定性能力有限，因而在复杂环境样品 痕量分析时的 化学干扰也常影响痕量测定时的准确性，从而限定了他们在多残留 超痕量分析中的应用。自从80年代末 大气压 电离质谱(APIMS)成功地与HPLC联用以来，HPLC-MS已经在 农药残留分析中占了很重要的地位，成为农药残留分析最有力的工具。