尿素酶

尿素酶是一种人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染中常见的酶，它既是人和动物中某些致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必须具备的酶之一. 它是人类首次获得晶体并发现含有Ni离子的金属酶〔7〕。    

　Hp尿素酶除有尿素酶的一般理化性状外，还有其独特性. Hp尿素酶分子量为550KDa左右，直径?13nm?，等电点5.99±0.03，最适温度45℃，最适pH 8.2. Km值?0.3mmol/L?±?0.1mmol/L?，在饱和条件下纯化的尿素酶活性为每毫克蛋白质每分钟水解?1100μmol?±?200μmol?尿素，较低Km值有助于Hp的尿素酶在尿素浓度较低的人胃环境中始终处于饱和状态而发挥最大的功能〔8,9〕. Hp尿素酶单体由A，B两个亚单位组成，呈六聚体，A，B两个亚单体的?Mr分别为?30000?和?64000?左右，其比例为?1∶1?，而其他菌属所含尿素酶则有三个亚单位组成〔7，8，10〕. Hp的尿素酶量很大，占全菌蛋白的5%～10%?〔11〕. 尿素酶一般为胞质蛋白，而Hp具有大量高活性的胞外尿素酶〔12〕，Hp产生的尿素酶活性相当于奇异变形杆菌的2倍，尿素酶阳性肠道菌的7倍〔13〕，故尿素酶活性的测定可以作为Hp的快速诊断方法〔8〕.?

　　方法一：尿素— 苯酚红法（美国大豆协会） 　　１ 原理 　　尿素酶活性是大豆饼粕类加工正确与否的标志，它的活性的高低与大豆饼粕加工（热）程度有直接关系，此方法是在指示剂苯酚磺存在的条件下，按尿素转变成氨的方法定性测定豆粕中尿素酶的活性。 　　２ 试剂 　　（１）0.1mol/L硫酸（将6ml深度硫酸缓缓注入1000ml水中） 　　（２）0.2mol/L氢氧化钠：取0.8g氢氧化钠加蒸馏水，溶解成100ml 　　（３）尿素— 苯酚红（别名：酚磺肽、酚红）试剂：将 1.2g苯酚红溶于30mL0.2mol/L氢氧化钠溶液中，用蒸馏水稀释至300mL；加入90g尿素并溶解之，用蒸馏水稀释至 2L；加 70mL0.1mol/L硫酸；稀释至3L。 　　注意：配好的溶液应具有明亮的琥珀色，若溶液转变成桔红色时，应滴加0.1mol/L硫酸，调至呈琥珀色，试剂最好在试验前配制，现配现用。尿素—苯酚红试剂有效期仅90天。 　　3．测定方法 　　（１）取粉碎好的豆粕，均匀地平铺于培养皿中（注意铺薄薄一层）。 　　（２）用滴管吸取尿素— 苯酚红试剂，小自心滴在被测定的样品中，将培养皿中豆粕全部浸湿。 　　（３）放置5分钟后观察结果： 　　①没有任何红点出现，再放置25分钟，若还无红点出现，说明没有尿素酶活性，是豆粕加工过熟了。 　　②有少数红点，为少量尿素酶活性，豆粕可用。 　　③豆粕表面有25%的红点覆盖，有少量尿素酶活性，可用。 　　④豆粕表面出现50%的红点覆盖，尿素酶活性大，应慎用。 　　⑤豆粕表面的 75%一100%为红点覆盖，尿素酶活性很高，说明豆粕过生，无法使用。 　　方法二： 　　1、原理 　　酚红指示剂在PH6.4—8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶，在室温下可将尿素水解，产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红时间长短来判断尿素酶活性大小。 　　2、仪器和试剂 　　（1） 粉碎装置：粉碎时应不产生强烈发热（如研体球磨机） 　　（2） 天平：感量0.01g 　　（3） 试管：直径1.8cm，长15cm 　　（4） 尿素：分析纯 　　（5） 酚红：分析纯、0.1%乙醇（20%）溶液 　　3、测定步骤 　　将试样研细，称取0.02g试样,称准至0.01g重，转入试管中，加入0.02g结晶尿素及两滴酚红指示剂，加20—30mL蒸馏水，摇动10s钟。观察溶液颜色，并记下呈粉红色的时间。 　　4、尿素酶活性的测定结果表示： 　　（1）1分钟内呈粉红色为活性很强。 　　（2）1—5分钟内呈粉红色为活性强。 　　（3）5—15 分钟内呈粉红色为有点活性。 　　（4）15—30分钟内呈粉红色为没有活性。 　　通常10分钟以上不显粉红色或红色的大豆制品，其尿素酶活性即可认为合格。