蛋白质纯化

　　蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。

　　一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。其蛋白质分离纯化主要方法包括：

　　（1） 根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)

　　（2） 利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)

　　（3） 根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；

　　（4） 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）

　　（5） 根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）

1. 菌液体积-起始目的蛋白量

2. 细菌裂解获得可溶蛋白

·  BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法

·  机械破碎（如超声等）Ni-NTA 树脂纯化

1. Ni-NTA树脂的兼容性

2. 天然条件纯化

·  柱层析

·  FPLC

·  批次小量纯化

3. 变性条件的纯化

·  柱层析

·  FPLC 纯化

·  批次小量纯化

4. 树脂再生

5. 常见问题与改善建议

一、亲和纯化样品的前处理

1. 菌液体积-起始目的蛋白量

纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采

用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积

的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的

裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。

例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml 的培养物离心获得的菌体，

按浓缩100 倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。

在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100 倍浓缩。

表1 确定所需菌液体积

His·Tag融合蛋白浓度表达水平培养体积 His·Tag融合

蛋白总量

浓缩系数

（在1ml溶液中裂解后）

变性条件

50mg/L 40% 3ml 150μg 3×

10mg/L 8% 10ml 100μg 10×

2mg/ L 1.6% 25ml 50μg 25×

0.5mg/ L 0.4% 50ml 25μg 50×

0.1mg/ L 0.8% 100ml 10g 100×

天然条件

>1mg/ L >1% 50ml >50g 50×

<1mg/ L <1% 100ml <100g 100×

与其它亲和纯化介质一样，His·Bind 树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌

抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS-PAGE，Western blot，S·TagTM

Rapid Assay，FRETWorksTM S·Tag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。

2. 细菌裂解获得可溶蛋白

·  BugBuster Master Mix蛋白抽提方法

BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶

液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预

混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和500ml包装分别足够用于20g和

100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。

可溶蛋白制备

采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考

Novagen的TB055“PET系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀

也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。

1. 用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml或更

少），可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。

2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml抽提试剂。这相当于

50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，

1.5ml培养液采用300μl抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。

选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号

69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽

管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。

3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。

注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。

4. 4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）

的材料。

5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很

多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋

白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。

高纯度包涵体的制备

以下操作可用于任何BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。

1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。

2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。

吸打并涡旋以获得均匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解、去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体。

3. 加入rLysozyme™溶液至终浓度为1KU/ml。温和涡旋混匀，室温孵育5分钟。

注意：如果采用的是BugBuster Master Mix就不需要另加rLysozyme了（即可省去此步操作）。

4. 加入6倍体积的经1:10去离子水稀释的BugBuster重悬，涡旋1分钟混匀。

5. 于4℃，5,000g离心15分钟，以吸管移去上清，收集包涵体。

6. 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的BugBuster中，涡旋混匀，如步骤5离心。此步骤

重复两次。再次重悬，于4℃，16,000g离心15分钟并去除上清。

7. 重悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液，最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。包涵体可以

重悬于Novagen的蛋白重折叠试剂盒（货号70123）中的1×溶解缓冲液（参考操作手册TB234）或其它变性

剂。不溶的His•Tag®融合蛋白可以用含有变性剂的1×结合缓冲液重悬用于His•Bind®纯化（IDA或NTA）。

机械破碎（如超声等）

可溶蛋白的制备

稀释8×储液制成1×结合缓冲液，或按照缓冲液成分列表自己配制（参考Novagen 目录或树脂英文说明书）。

1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入4ml (1:25 v/v)

缓冲液，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液或1×Fractogel 结合缓冲液中。也可加入NP-40 或其他非离子型

去污剂至终浓度0.1％，以减少非特异性结合。若细菌菌体重悬困难，可使用匀浆器、搅拌器或超声仪帮助打

散菌体。

2. 将重悬菌液置于合适大小的容器中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中。超声条件依赖于

所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状，须实验者自己摸索。应避免连续超声导致的大量产热，

可分成短时间、多次超声。通过一定的间隔时间避免溶液过热。若DNA 未能被超声剪切，裂解液会十分粘

稠，可能阻塞色谱柱，降低流速，影响后续的纯化过程。大量的菌体可选用弗氏压碎法(French Press)。

包涵体的制备

使用1×结合缓冲液从大肠杆菌中分离、洗涤包涵体，除去杂质蛋白，再用含6M 盐酸胍或6M 尿素的1×结合缓

冲液溶解包涵体。

1. 10,000g 离心10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入40mI 1×结合

缓冲液比例重悬菌体。此步骤不加变性剂。

2. 按前述方法进行超声，重悬菌液，剪切降解核酸。

3. 5,000g 离心15 分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中。

4. 移去上清，每100ml 培养物的沉淀重悬于20ml 1×结合缓冲液，重复第3 步。可能需要超声以彻底重悬沉

淀。

注意： 本步操作可加入rLysozymeTM溶液（非必要）帮助处理包涵体。已证实溶菌酶可消化细胞壁，提高包涵体

纯度。将rLysozyme 加入1×结合缓冲液至终浓度1KU/ml，轻柔混匀，孵育5-10 分钟即可离心。

5. 移去上清，按每100ml 培养物加5mI 缓冲液比例，加入含6 M 盐酸胍或6 M 尿素的1×结合缓冲液重悬沉

淀。

6. 冰浴孵育1 小时，彻底溶解包涵体。16,000g 离心30 分钟去除不溶成分，His·Bind 纯化之前用0.45um 滤膜

过滤上清。

二、亲和纯化步骤

Ni-NTA 树脂纯化

Ni-NTA His·Bind 树脂不能耐受高浓度还原剂，如DTT、DTE，这些还原剂会还原Ni 离子，使其无法与His·Tag

融合蛋白结合。被还原的树脂呈棕色。多数情况下，可以使用巯基乙醇，其浓度可以加至20mM。

EDTA、EGTA，或其它强螯合剂会与Ni2+结合，将其从树脂上剥离下来。Ni2+被螯合后，树脂呈白色。

对任何还原剂或螯合剂，请小心对待。若不能确定，请先在小量树脂上进行试用。应尽量避免缓冲液中含有任何

高浓度供电子基团成分(如NH4+)、或裂解物中含诸如Arg、GIn、Gly、His 等氨基酸。

菌体应在无强螯合剂(如EDTA)、无强还原剂(如DTT)、无离子型去污剂(如SDS)的情况下裂解。尽管确实存在某

些例子，在这些试剂存在的情况下成功纯化出目的蛋白，但还是建议大家避免使用这些试剂。

更多信息请参考2。

2. 天然条件纯化

在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不

溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 Ni-NTA His·Bind 树脂纯化出来。

在没有强变性剂如尿素的情况下，细胞裂解物中部分不稳定的蛋白可能容易被降解。最好始终保持蛋白溶液处于

低温0-4℃，并快速操作。加入AEBSF 或蛋白酶抑制剂混合物系列III 货号101500 和 539134），可能帮助蛋白

稳定（视具体情况而定），但是需要考虑到它们对重组蛋白的可能影响。

天然条件纯化所需缓冲液（试剂盒70899）

1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤）

50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑

（加入1/10 体积的10×BugBuster 或溶菌酶能获得更好裂解效果。参见前述“制备细菌裂解物”部分。）

1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑

1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑

柱

2. 天然条件纯化

在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不

溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 Ni-NTA His·Bind 树脂纯化出来。

在没有强变性剂如尿素的情况下，细胞裂解物中部分不稳定的蛋白可能容易被降解。最好始终保持蛋白溶液处于

低温0-4℃，并快速操作。加入AEBSF 或蛋白酶抑制剂混合物系列III 货号101500 和 539134），可能帮助蛋白

稳定（视具体情况而定），但是需要考虑到它们对重组蛋白的可能影响。

天然条件纯化所需缓冲液（试剂盒70899）

1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤）

50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑

（加入1/10 体积的10×BugBuster 或溶菌酶能获得更好裂解效果。参见前述“制备细菌裂解物”部分。）

1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH2P04，pH 8.0，300mM NaCI，20mM 咪唑

1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCI，250mM 咪唑

柱

批次小量纯化

实验材料

·小离心管

·溶菌酶（货号71110）

·Ni-NTA His·Bind 树脂（货号70666）

·1×Ni-NTA 结合缓冲液（缓冲液试剂盒货号70899）

·1×Ni-NTA 漂洗缓冲液

·1×Ni-NTA 洗脱缓冲液

1、取1ml 菌液，加入一个小离心管中。

需要破碎多少菌体依赖于目的蛋白的表达水平。若蛋白高水平表达，1ml 菌液所含目的蛋白就足够了（参考表

1）。若蛋白表达水平低，可能需要更大体积的菌液。若需要检测诱导培养时间对蛋白表达水平的影响，每隔30

分钟从培养体系中取出1ml 菌液，离心收集菌体，-20℃保存，直至所有样品收集完全。

2、15,000g 离心1 分钟，收集菌体，弃上清。

若需要更大体积的菌液，可向离心后去除上清的离心管中再加入菌液，再次离心，从而获得更多菌体。

3、将细胞沉淀在-20C 冷冻15-20min。

4、将细胞完全解冻，用100μl 1×Ni-NTA 结合缓冲液重悬菌体。

若仅取1ml 菌液，浓缩系数为10，对于某些需要在天然条件下纯化的蛋白来说可能不够，请参考表 1 。

5、加入溶菌酶4.5-6KU 30 度孵育15min。

6、轻柔涡旋，裂解细胞，避免起泡。

可选做：每100μl 重悬细胞加入2.5u Benzonase 核酸酶。可将Benzonase 稀释10 倍（2.5u/ul）以方便取用

（稀释缓冲液请垂询）。

7、裂解物15,000g 离心10min。除去细胞不溶残片，上清转入干净小管中。

8、每管加入 20μl 50% Ni –NTA His·Bind 树脂悬液（相当于 10μl 树脂，可结合50-100μg His·Tag®融合蛋

白），4℃轻柔混匀，结合30 分钟。

9、15,000g 离心10 s 沉淀树脂，取 10μl 上清转入另一干净小管中，以备电泳分析。弃去其它上清。

上清留样保存于冰上。

3. 变性条件的纯化

变性条件纯化所需缓冲液

变性裂解／结合缓冲液

Buffer A：6M Gu-HCI；0.1M NaH2P04 ；0.01M Tris-CI，pH8.0

Buffer B：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI，pH8.0

变性漂洗缓冲液

Buffer C：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH6.3

变性洗脱缓冲液

Buffer D：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH5.9

Buffer E：8M 尿素；0.1M NaH2P04；0.01M Tris-CI pH4.5

注意：Buffer B、C、D、E应在使用前调至适宜pH值，以避免尿素解离。

柱层析

实验材料

· 变性裂解／结合缓冲液裂解制备的细菌裂解物（ 20-200ml 菌液体积）。

· Ni-NTA His·Bind 树脂（货号70666）

· 空色谱柱（货号69673）

· Buffers A- E

1、将 1ml 50% Ni-NTA His·Bind 树脂悬液加到 4ml 细胞裂解液中，轻柔混匀（如旋转混合器200rpm ） ，室

温结合15-60min。

需要破碎多少菌体根据所使用的表达体系和His·Tag®融合蛋白的表达水平。Ni-NTA His·Bind 树脂与不同的

His·Tag®融合蛋白的结合能力不同，通常为5-10 mg/ml 。如 Ni-NTA His·Bind 树脂或Ni-NTA His·Bind

Superflow 对 His·Tag DHFR（～26 kDa）的结合量为 0.3μmol/ml （8.0 mg/ml ）。请参考表 1。对于高表达水平的目的蛋白（每升培养基 50-100mg His·Tag 融合蛋白），可用5 倍浓缩的细菌裂解物（如

20ml 菌液离心获得的菌体重悬于4ml Buffer B ）。4ml 5 倍浓缩的裂解物含有约1-2mg 的 His·Tag 融合蛋白。

对于低表达水平的蛋白（ 1-5 mg/1 培养基），可以50 倍浓缩，抽提 200ml 菌液，获得 4ml 的细菌裂解物（4ml

细菌裂解物＝0.2-1mg His·Tag 融合蛋白）。

2、将裂解液与Ni-NTA His·Bind 树脂的混合物小心加入下端封闭的空色谱柱中。

3、除去柱下端封闭盖子，收集流出液（穿过峰），保存用于SDS- PAGE 电泳分析。

4、以 4ml buffer C 漂洗杂蛋白2 次。

保存漂洗组分用于SDS- PAGE 电泳分析。

5、以 0.5ml buffer D 洗脱目的蛋白4 次，再以0.5ml buffer E 洗4 次，收集组分，用SDS-PAGE 分析。

蛋白单体通常用 buffer D 即可洗脱，而多聚体、聚合物和含两个His·Tag 标签的蛋白通常由buffer E 洗脱。

1、处理过程为单纯物理过程，无任何相变。设备操作温度低，避免了传统工艺的种种弊端;

2、系统采用先进的膜分离技术，工艺简单，运行稳定可靠，处理效率高;

3、可以对生产废水中的有用物质进行提纯回用，实现经济、环保双赢;

4、设备投资少，运行费用低。^[1]

1、 化学物质的分离、提纯、浓缩;

2、染料、染料中间体的浓缩及脱盐

3、超细粉体生产过程中的产品回收;

4、生产废水中有用物质的提纯、回用;

5、海洋生物提取物的浓缩、提纯

6、氨基酸、蛋白质的浓缩、提纯。