蛋白质亚基

       种子蛋白质亚基分析（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）

　　一、目的
　　蛋白质分子有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式,组成蛋白质分子的单条肽链又称亚基.通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的比较,可以研究种子蛋白质分子组成和结构.另外,SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基分子质量的好方法.通过本实验,学习SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用.
　　二、原理
　　用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（琉基乙醇或二硫苏糖醇）热处理蛋白质样品,蛋白质分子中的二硫键被还原,解离的亚基与SDS发生1:1.4的定量结合.SDS使蛋白质亚基带上大量负电荷,掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异.亚基的构象均呈长椭圆棒状,各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度.在电场中其迁移速率仅与亚基分子质量有关,因此,SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳可以进行蛋白质亚基分离,并用来测量蛋白质亚基的分子质量.
　　三、仪器、试剂和材料
　　1．仪器
　　(1）稳压稳流电泳仪
　　(2）垂直板电泳槽
　　(3）微量注射器
　　(4）烧杯50mlX2
　　(5）白瓷盘
　　(6）脱色摇床
　　(7）吸管0.5mlX2,5mlX2,10mlX3
　　(8）真空泵
　　(9）台式高速离心机
　　2．试剂
　　(1)2%琼脂2g琼脂加电极缓冲液100ml,水浴中溶化.
　　(2）电极缓冲液Tris6g,Gly28.8g,SDS2g,去离子水溶解后,用Hcl调pH值至8.3,水定容至2000ml.
　　(3)30%AerAcr30g,水溶后定容至100ml,过滤,冰箱中贮存备用.
　　(4)1%BisBis1g,水溶后定容至100ml,过滤,冰箱中贮存.
　　(5）分离胶缓冲液（1.5mol/lTris,pH8.7)Ths15.17g,适量水溶解,然后用lmol/lHCI调pH值至8.7,定容至100ml.
　　(6）浓缩胶缓冲液（0.5mol/lTris-Hcl,pH6.8)Tris6.06g,适量水溶解,然后用lmol/lHCI调pH值至6.8,定容至l00ml.
　　(7)10%SDSSDS1g,加水10ml溶解.
　　(8)10％过硫酸铵1g过硫酸铵,加水10ml溶解,现用现配,冰箱中最多可贮存一周.
　　(9)TEMED（四甲基乙二胺）4℃,棕色瓶中贮存.
　　(10)样品缓冲液（pH8.0)Tris6.05g,甘油50ml,巯基乙醇25ml,溴酚蓝0.5g,SDSl0g,溶于水,用HCI调PH至8.0,定容至500ml.
　　(11)脱色液甲醇：乙酸：水＝5:1:5（体积比）
　　(12)染色液（0.25%考马斯亮蓝R250）1.00g考马斯亮蓝R250,用脱色液400ml溶解,过滤备用.
　　(13)低分子质量标准蛋白溶液,包括溶菌酶（MW=14400Da）大豆胰蛋白酶抑制剂（215000）、碳酸酐酶（310000）、卵白蛋白（450000）、牛血清白蛋白(662000）、磷酸化酶B(925000）.用样品缓冲液配成2mg/ml溶液,在沸水浴中加热3-4min,冷却后使用.
　　(14)高分子质量标准蛋白溶液包括卵白蛋白（MW=450000）、牛血清白蛋白（662000）、磷酸化酶B(925000）、?一半乳糖苷酶（1162500）、肌球蛋白重链(2000000),配制方法同（13）.
　　(15)25%乙醇.
　　四、操作步骤
　　(1）在制板支架上置一专用有机玻璃槽,将固定好的玻璃板下部插入槽内,中部用两个文具夹固定在支架竖板上,在槽内倒入已充分溶化的琼脂,冷凝后封闭胶腔底部.
　　(2）取50ml烧杯1只,加30%Acr18.8ml,1%Bis4.7ml,pH8.7Tris-HCI缓冲液11.3ml,H2O9.8ml.混匀后压抽气5min.取出后向烧杯中再加10%SDS0.5ml,10%过硫酸按0.2ml,TEMED50μl,轻轻摇匀后灌入玻璃板胶腔中至适当高度,加25%乙醇约0.5cm封闭表面.
　　(3）待分离胶聚合后,倒掉乙醇溶液,再灌浓缩胶.操作方法：另取50ml烧杯1只,加30%Acr3.0ml,1%Bis3.0ml,pH6.5Tris-HCI缓冲液7.5ml,H2O16.5ml.混匀后减压抽气.取出后向烧杯中再加入10%SDSO.3ml,10%过硫酸按0.2ml,TEMED50μl,轻轻混匀后灌满玻璃板胶腔,迅速插入样品梳,静置聚合.
　　(4）待测样品用样品缓冲液配制成lmg/ml左右的溶液,在沸水浴中加热3-4min,冷却后在台式高速离心机上离心（10000r/min,10min),取上层液备用.
　　(5）拔掉样品梳,装好电泳槽,在上、下槽中注入电极缓冲液,用微量注射器点样,每样品槽点样20-50μl.在标准蛋白泳道点标准蛋白质溶液.
　　(6）上槽为负极,下槽为正极,连接好电泳仪电源,恒压（l00V左右）或恒流(30mA左右）电泳.当指示染料溴酚蓝到达凝胶前沿还有1-2cm时停止电泳,倒掉电极缓冲液,剥胶染色.
　　(7）剥胶后用蒸馏水洗涤胶片,然后浸入染色液中4-5h或过夜.取出后用蒸馏水漂洗数次,浸入脱色液中振荡脱色,中途更换脱色液数次,至背景清晰透明为止.照相或进行凝胶干燥.
　　(8）凝胶干燥先在一块玻璃板上铺一张用水浸润透的玻璃纸,放上胶片,再盖上一张同样处理过的玻璃纸,用玻璃棒赶出可能窝藏的气泡.然后把玻璃纸多余的四边反向贴到玻璃板后面,在室温下自然风干,制成可以长期保存的透明胶片.
　　五、结果处理
　　量出染料及各区带迁移距离,以标准蛋白分子质量的对数对相对迁移率做图,得标准曲线.根据待测样品的相对迁移率,从标准曲线上查出其分子质量的对数,再求出其分子质量.
　　六、注意事项
　　(1)Acr、Bis有神经毒性,操作时要小心.
　　(2）不同的凝胶浓度适用于不同的分子质量范围.可根据所测分子质量的范围选择最适的凝胶浓度,并尽量选择分子质量范围与待测样品分子质量相近的蛋白质作标准蛋白质