疏水柱层析

中文名 疏水柱层析
定义 分离生物大分子的一种方法
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原理

疏水作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)是根据分子表面 疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团,我们把这些疏水性基团称为疏水补丁,疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同,它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同,疏水作用 层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

操作特点

疏水层析的基本操作与其他层析大致相同。所要注意的事项有以下方面:

1、层析柱的制备   进行疏水层析时,所使用层析柱之规格包括柱体积大小、直径粗细、柱高度(h)与其直径(d)的比值等,均与普通层析的相似。在分离样品量较大时,宜选用体积较大的层析柱,h:d的比值应≤3。

2、平衡   疏水层析柱装柱完毕后,通常要用含有高盐浓度(如1mol/L (NH4)2SO4或2mol/L NaCl)的缓冲液进行平衡。

3、加样与 洗脱   加样前,在样品溶液中要补加适量的盐类。通常加1mol/L (NH4)2SO4或2mol/LNaCl,以使样品中的生物大分子局部变性,并能与固定相很好地相互吸附。加盐的样品溶液要混匀,放置片刻后即可上柱,当把此样品溶液徐徐加入固定相(使生物大分子与固定相之间作用0.5~1h)后,先用平衡缓冲液洗涤,再用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。

4、再生   洗脱后的层析柱欲重复使用时,需对其固定相进行再生处理,即用8mol/L 尿素溶液或含8mol/L尿素的缓冲溶液洗涤层析柱(以除去固定相吸附的杂质),接着用平衡缓冲液平衡。采用此程序处理过的疏水层析柱,可重复使用。

特点与应用

1、疏水柱层析特点:(1)疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液;(2)分辨率很高、流速快、加样量大;(3)疏水性吸附剂种类多,选择余地大,价格与离子交换剂相当。

2、疏水柱层析应用:疏水柱层析适用于分离的任何阶段,尤其是样品 离子强度高时,即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于 蛋白质类生物大分子分离纯化。

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